4.3. CONTROL GENÉTICO DE LA REPLICACIÓN

4.3. CONTROL GENÉTICO DE LA REPLICACIÓN

• REPLICACIÓN DEL ADN

Es el proceso mediante el cual la molécula de ADN hace copias de sí misma, esto se lleva a cabo en el período de interfase, en el Ciclo Celular.
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Para que se lleve a cabo esta replicación, se desenrrolla el ADN, se rompen los puentes de hidrógeno por medio de enzimas (helicasas), conforme se abre la molécula del ADN, las bases de los nucleótidos libres se unen cadenas sencillas, posteriormente se forman enlaces entre los fosfatos y los azúcares de los nuceótidos que se han apareado con las cadenas del ADN dando como resultado dos copias idénticas de la molécula original del ADN.
Recuerda que para una Adenina siempre se une una Timina por medio de dos puentes de hidrógeno, y para una Citocina se une una Guanina, mediante tres puentes de hidrógeno.

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Las enzimas que intervienen en la replicación son:

• Primasas: Originan los ARN colaboradores que son complementarios de ADN

• Topoisomerasas: desenrrollan el ADN.

• Helicasas: Separan las dos cadenas de nucleótidos.

• Proteícas SSB: mantienen separadas las dos heras monocatenarias.

• Nucleasas: Rompen los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos.

• Las Ligasas: unen a los fragmentos de polinucleótidos adyacentes.

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Una vez que se comprobó que el ADN era el material hereditario y se descifró su estructura, lo que quedaba era determinar como el ADN copiaba su información y como la misma se expresaba en el fenotipo. Matthew Meselson y Franklin W. Stahl diseñaron el experimento para determinar el método de la replicación del ADN. Tres modelos de replicación era plausibles.

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1. Replicación conservativa durante la cual se produciría un ADN completamente nuevo durante la replicación.

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 2. En la replicación semiconservativa se originan dos moléculas de ADN, cada una de ellas compuesta de una hebra de el ADN original y de una hebra complementaria nueva. En otras palabras el ADN se forma de una hebra vieja y otra nueva. Es decir que las hebras existentes sirven de molde complementario a las nuevas.

.3. La replicación dispersiva implicaría la ruptura de las hebras de origen durante la replicación que, de alguna manera se reordenarían en una molécula con una mezcla de fragmentos nuevos y viejos en cada hebra de ADN.

 

La iniciación de la replicación siempre acontece en un cierto grupo de nucleótidos, el origen de la replicación, requiere entre otras de las enzimas helicasas para romper los puentes hidrógeno y las topoisomerasas para aliviar la tensión y de las proteínas de unión a cadena simple para mantener separadas las cadenas abiertas.

Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la cadena en crecimiento. 

 

El proceso resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se ha estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo que se conoce como ciclo celular.

La levadura de cerveza (Saccharomycescerevisiae) es un hongo unicelular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. El ciclo de vida de las levaduras alterna dos formas, una haploide y otra diploide. Ambas formas se reproducen de forma asexual por gemación. En condiciones muy determinadas la forma diploide es capaz de reproducirse sexualmente. En estos casos se produce la meiosis en la célula formándose un asca que contiene cuatro ascosporas haploides.

S. cerevisiae es uno de los modelos más adecuados para el estudio de problemas biológicos. Es un sistema eucariota, con una complejidad sólo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas técnicas. Además de su rápido crecimiento, la dispersión de las células y la facilidad con que se replican cultivos y aíslan mutantes, destaca por un sencillo y versátil sistema de transformación de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulación con las mínimas precauciones.

S. cerevisiae es un sistema genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementación. Una levadura haploide contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2200 kilo bases (kb).

Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisión. Ello ha permitido la manipulación genética de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micro matrices de ADN para investigar el transcriptora y estudios a escala genómica de, entre otros muchos aspectos, la expresión génica, localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma.

La maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada tanto en levaduras como en plantas y en mamíferos. Esto se ilustra con el hecho de que rutinariamente se han introducido genes de eucariotas superiores en levaduras para el análisis sistemático de su función.

Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala de análisis de genómica funcional, proporcionando un punto de partida para el análisis de organismos eucariotas más complejos. Al ser un organismo unicelular con una tasa de crecimiento rápida, la levadura se puede utilizar para los estudios de células que resultarían muy complicados o costosos en organismos multicelulares.

Las utilidades industriales más importantes de esta levadura son la producción de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol durante el proceso de fermentación. Básicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azúcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metabólicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energético, y por tanto no realiza la fermentación.

Desde el punto de vista científico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la célula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de división celular (aproximadamente dos horas).

La mayor parte de los estudios de ciclo celular se han llevado a cabo empleando S. cerevisiae, la levadura del pan y la cerveza también conocida como la levadura de gemación por su característico estilo de división. En el caso de este organismo hay que añadir la ventaja de que actualmente se conocen los aproximadamente 16 millones de pares de nucleótidos que constituyen la secuencia completa de su genoma.

Figura: Ciclo celular de S. cerevisiae

Los fundamentos de nuestro conocimiento actual del ciclo celular en levaduras vienen de la búsqueda sistemática de mutaciones en genes que codifican para componentes de la maquinaria del ciclo. 

Estos estudios han permitido identificar una familia de proteínas quinasas dependientes de diclina, -Cyclin Dependent Kinases, Cdk- que incluyen a Cdc28 de S. cerevisiae, y a su homólogo en S. pombe cdc2, y que juegan un papel central en los procesos claves del ciclo celular: la entrada en ciclo, la síntesis de ADN y la regulación de la mitosis. Estas quinasas son las subunidades catalíticas de un complejo que incluye también un subunidad reguladora, denominada diclina, necesaria para la función del complejo al determinar la localización o la especificidad de sustrato de la quinasa.

En los últimos años se han encontrado también homólogos a estas quinasas en todos los eucariotas en los que se han buscado, y que incluyen desde el gusano nematodo Caenorhabditiselegans, a la mosca Drosophilamelanogaster, a mamíferos como el ratón y el hombre y plantas como Arabidopsis thaliana, indicando que el sistema de control del ciclo celular es general en todos los eucariotas y validando a las levaduras como modelos de estudio.

4.2. REPLICACIÓN DEL DNA EN EUCARIONTES

4.2. REPLICACIÓN DEL DNA EN EUCARIONTES

El proceso es esencialmente el mismo pero el ADN es mucho más grande y linear. Hay varios orígenes de replicación y es bidireccional. El avance es más lento que en procariotas ya que hay más proteínas asociadas al ADN que hay que soltar. 

La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada generación celular necesita de muchos "ladrillos", enzimas y una gran cantidad de energía en forma de ATP (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular, las células pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energía para la siguiente fase de la división celular). La replicación del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo. Los nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

El mecanismo para la síntesis del DNA en eucariontes probablemente es similar al proceso en procariontes.

Las principales complicaciones adicionales son que el DNA en eucariontes se organiza en varios cromosomas lineales y que el DNA es mucho más largo que el que se encuentra en los procariontes.

 El movimiento de la DNA polimerasa es mucho más lento que en los procariontes; para compensar esto, una célula eucarionte tiene más o menos 20 000 moléculas de la enzima. Esto permite que se forme un número mayor de horquillas de replicación, por ejemplo 2000 o más, en los cromosomas eucariontes. También se forman fragmentos de okazaki más pequeños, con longitud de 40 a 300 bases.

De esta manera en general la replicación del DNA es mucho más rápida que la de E. coli.

• TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN: SÍNTESIS DE LOS TELÓMEROS:

 

El final de la replicación en eucariotas tiene que resolver el problema del acortamiento de los cromosomas. Para ello ha desarrollado la estructura de los telómeros y telosomas, y la actuación de una nueva enzima emparentada con las retrotranscriptasas: la telomerasa.

4.1 REPLICACIÓN DEL GENOMA PROCARIÓTICO

4.1 REPLICACIÓN DEL GENOMA PROCARIÓTICO 

Aunque las actividades enzimáticas sean las mismas en procariotas y eucariotas, hay muchas más proteínas implicadas en la replicación de los eucariotas. Por otro lado, el DNA eucariótico tiene más problemas con el superenrollamiento al estar muy estrechamente asociado a unas proteínas denominadas histonas. También es distinto el hecho de que en un cromosoma procariótico sólo hay un origen de replicación en el único cromosoma, mientras que en los de eucariotas suele haber muchos más (a veces más de 30.000) por cada cromosoma. Los múltiples orígenes de replicación en eucariotas aseguran que el genoma se puede replicar en muy poco tiempo.

Arquitectura del genoma en procariotas

 

Tamaño del genoma

• La mayor parte del genoma corresponde a genes. 
• Los genes carecen de intrones.

Una única RNApol transcribe los RNAm y RNA estructurales

 

En las células procariotas

Hay 1 lugar de origen de replicación que se muestra en la horquilla de replicación (replication fork) y que señala el avance de la copia. La horquilla (fork) indica que se está haciendo la separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado replisoma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo.

• DNA polimerasas procariotas:

Las DNA polimerasas  I, II y III se encuentran en las procariontes. En la siguiente tabla se resumen las  propiedades de las diferentes enzimas.

Propiedades de la DNA polimerasa de E: coli y de retrovirus.

                                          * Virus de la mieloblastosis avícola, un retrovirus.

La  DNA polimerasa I de E. coli es una sola cadena polipeptídica de Mr 109 000. Contiene un átomo de zinc por molécula. Cataliza la polimerización en el sentido 5´         3´.

Todas las polimerasas de procariontes muestran actividad exonucleasa, es decir pueden hidrolizar DNA, en procariontes pueden hidrolizar DNA de cadena sencilla (en la dirección 3´      5´) y de cadena doble (en la dirección 5´         3´).

LA DNA polimerasa III de E. coli está formada por 7 subunidades: a, b, g, d, e, q y t. Las siete son esenciales para la actividad máxima.

La DNA pol. III es la principal enzima de replicación en E. coli. La DNA pol. I es responsable de la reparación de DNA dañado. La función de la DNA pol II no está todavía clara.

• DNA polimerasas eucariotas:

                                                    Tabla. DNA polimerasas eucariontes.

Se conocen cinco polimerasas eucariontes (a, b, g,d y e.) y tienen un mecanismo de acción similar al de las enzimas procariontes.

Las DNA pol. ayd son las que están asociadas más directamente a la replicación del DNA cromosómico.

La DNA pol. bes responsable de la reparación del DNA. L DNA pol.g  se encuentra en las mitocondrias y se encarga de replicar el DNA mitocondrial. La DNA pol. eEs recién descubierta y se asemeja en funciones a d.

Los retrovirus contienen RNA y no DNA como material genético, y tienen una DNA polimerasa dependiente del RNA (una transcriptasa inversa).

EVIDENCIAS DE TRABAJOS

 

INTRODUCCIÓN 

La propiedad más notable de las células vivas es su capacidad de reproducirse con una fidelidad casi perfecta, no solamente una generación, sino durante centenares y millares de generaciones. El modelo que explica cómo se duplica el DNA se denomina modelo semiconservativo ya que a partir de una molécula de ADN obtendremos dos exactamente iguales, cada una con una hebra antigua (cadena parda en la imagen siguiente) y otra nueva (cadena naranja en la imagen siguiente): la cadena original comienza a separarse de un extremo a otro de modo que cada una de las hélices va a sintetizar una hélice nueva complementaria habiendo tomado como modelo o patrón a la hélice inicial.

 INFORME

REPLICACIÓN DEL ADN

El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite alADNduplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

Replicación de ADN. La doble hélice es desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la síntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa añade los nucleótidos complementarios a los de la cadena original.

• FUNCIONES QUE DEBE CUMPLIR EL CROMOSOMA: SIGNIFICADO GENÉTICO DE LA REPLICACIÓN

Las principales funciones que debe cumplir un cromosoma son la de replicarse(producir copias de si mismo), la de transmitirsede una célula a otra y de una generación a la siguiente y la de expresar la información que contiene.

 BACTERIA

 

BACTERIA DIVIDIENDOSE

BACTERIAS DECENDIENTES

El significado genético de la replicación es el de conservar la información información genética, de manera que cuando una bacteria se divide, de lugar a una bacteria hija que contenga la misma información genética.

En organismos eucariontes el significado de la división celular es el mismo, una célula cuando se divide origina dos células hijas idénticas con la misma información genética.

• MODELOS DE REPLICACIÓN PROPUESTOS: SEMICONSERVATIVO, CONSERVATIVO Y DISPERSIVO

En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicación del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicación es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicación:

*     Modelo Semiconservativo: Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hélice indicaron que dicho modelo sugería una forma sencilla de replicación. El modelo de replicación propuesto por Watson y Crick suponía que el ADN doble hélice separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo recibió el nombre de Semiconservativo, ya que las dos dobles hélices recién sintetizadas poseen una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad nueva).

Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon otros posibles modelos de replicación del ADN, uno de ellos se denominó Modelo Conservativo y otro Modelo Dispersivo.

*     Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hélice se replica se producen dos dobles hélices, una de ellas tienen las dos hebras viejas (esta intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis.

*     Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hélice se replica se originan dos dobles hélices, cada una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes proporciones.

Los siguientes esquemas representan los tres Modelos de Replicación:

Semiconservativo

Conservativo

Dispersivo

 

• LA REPLICACIÓN DEL ADN BACTERIANO SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTOS DE MESELSON Y STAHL (1958).

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: ¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo? Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N¹⁵, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N¹⁵. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N¹⁵). Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN de las bacterias que crecían en un medio normal (con N¹⁴) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N¹⁵. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N¹⁵ era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N¹⁴.  Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N¹⁵) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N¹⁴ (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.

Esquema Experimentos Meselson y Stahl (1958).

Cuando extraían el ADN de las bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N¹⁴ y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La absorbencia  a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbencia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N¹⁴ era tres veces mayor que la encontrada en la  banda de densidad intermedia (N^14-15), proporción (3:1).

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N¹⁴, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N¹⁵ (la vieja) y la otra hélice con N¹⁴ (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N¹⁵ y otra menos densa sintetizada con  N¹⁴. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una replicación semiconservativa.

Resultados centrifugación CsCl.

 

Matthew Meselson y Franklin W. Stahl

Si la replicación del ADN de E. coli se ajustará al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las bacterias después de una generación en medio con N¹⁴, hubieran obtenido dos bandas una de densidad correspondiente al N¹⁴  y otra de densidad correspondiente al N¹⁵. Nunca habrían observado, en este caso,  una banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15).

OBJETIVO Y METODOLOGÍA

OBJETIVO

• Entender como se transmite la información genética entre los seres vivos Y su relación con los mecanismos de herencia.

• Distinguir los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y  eucariotas.

METODOLOGÍA

En el bloque IV mi objetivo a realizar será a través de compromiso de investigación por medio de un espacio virtual, con el que aportare información de algunos elementos de trabajos a elaborar, la metodología a realizar será por medio de el ordenamiento temático de esta unidad con lo ejecutare dicha investigación y se proporcionará esta averiguación de temas en esta red conforme el profesor de conocer el de tema visto en la clase.