El presente
resumen corresponde a la materia de biotecnología aplicada, procedente a la unidad
II “Cultivos de tejidos vegetales”. Su organización se ha
conformado a partir del temario correspondiente a la asignatura. En cada uno de
ellos se engloban temas y subtemas que se articulan posteriormente:
¿Qué es un medio de cultivo vegetal? Un medio de cultivo es una
solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan
los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes
(Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de
carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética
de los tejido in vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos,
Vitaminas y Reguladores del Crecimiento.
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones
concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se
pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de
precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos
para mantener su disponibilidad durante el cultivo.
Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida
o con un agente gelificantes como el agar.
Las áreas del laboratorio de cultivos
vegetales., son aquellas que forman parte de la preparación de medios, cómo
son:
1. Área
de preparación.
2. Área
de lavado y esterilización.
3. Área
de transferencia
4. Área
de incubación
5. Área
de observación y examen
6. Área
de crecimiento
7. Área
de cuarentena y de control fitosanitario
El material y equipo de laboratorio a
utilizar en la preparación de los medios de cultivos vegetales son:
- Área de preparación de medios
- Área de oficina
- Área de esterilización
- Área de siembra
- Área de incubación
En este
apartado se mencionaran algunas de las generalidades de los medios de
cultivo:
Los
componentes de los medio de cultivo vegetal., son aquello (a) s:
Para la preparación y manejo de soluciones stock para el medio MS, se
requieren de los métodos que se mencionaran posteriormente, los cuales se emplearan
para la preparación de 4 reactivos que compone al medio de cultivo para la
propagación de plantas in vitro.
- Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)
- Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)
- Preparación de una solución stock de hierro MS x 200 (solución 3)
- Preparación de una solución stock de vitaminas y inositol MS x 200 (solución 4)
Para la preparación de los medios de cultivo, se requiere de una
formulación de datos adicionales para los medios:
CASO:
Preparar 500 mL De Un Medio MS
(1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x,
añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.
Fórmula para utilizar ciertos
ml de la solución de 50x y verterlo para hacer 500 ml.
Después de haber agregado las
5 soluciones stock en el matraz. Se agrega después la sacarosa agregando 100 ml
de agua, con forme se agrega la sacarosa. Después aforar a 500 ml, después se
regula el pH entre 5.6 y 5.8 utilizando HCL o KOH para subir o bajar el pH.
Después se agrega el Phytagel, se calienta a 40 °C, Aquí puede agregarse el
Phytagel, se deja hervir por 2 minutos, después se saca y enfría poco a poco y
se agrega a cada frasco con una cantidad a 20 ml.
¿Qué es la
esterilización?
Es una
serie de métodos físico-químico, que sirven para eliminar los microorganismos y
esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivos.
También se
le conoce como proceso de esterilización
por medio del cual un material, superficie o sitio se libera de cualquier
microorganismo o espora.
Los métodos de esterilización
comprenden entonces, todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos que
se emplean para destruir gérmenes patógenos:
Los más utilizados en la actualidad son los
métodos físicos (calor, radiaciones, filtración, centrifugación) y los métodos
químicos (agente químico).
Cuáles son los factores que intervienen en el proceso de
esterilización:
La eficacia de un proceso de
esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí y de múltiples
factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación
inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de
envoltorio, etc. Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza,
preparación del equipo, esterilización, almacenaje y transporte) deben
validarse y controlarse;
1. Factores
relacionados con el objeto
2. Limpieza
del material previa a la esterilización
3. Agua
4. El
detergente
El establecimiento en el cultivo de tejidos
vegetales consiste en tomar una porción de una planta (a la
que se denominará explante, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella,
segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla
en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde
se regenerarán una o muchas plantas.
La
formulación del medio cambia según se quiera obtener un
tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones
somáticos para producir semillas artificiales.
El éxito en
la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la
potencialidad celular total, es decir, que algunas células
recuperen su condición meristemática.
Un proceso de este tipo sucede durante la
formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la
formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias,
violeta africana opeperonias mediante porciones de hojas.
Las fases de Micropropagación en el establecimiento
de los cultivos vegetales., constan de 4 periodos:
0
ELECCIÓN de la planta y/o tejido donante de explantes.
Particularidades:
1.- Sanidad
2.- Que sean plantas herbáceas
3.- Edad del explante
4.- Genotipo
5.- Época del año
5.- Época del año
6.- Edad de la planta
7.- Efecto posición y competencia
1
ESTABLECIMIENTO, que consiste en la desinfección de los explantes
(generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al
medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático
según se desee.
2
MULTIPLICACIÓN, para generar una masa vegetal suficiente para la
regeneración del número de plantas necesarias.
3
ENRAIZAMIENTO, en la que se busca la formación
de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos
en plántulas completas.
4
RUSTICACIÓN, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas
in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato
inerte).
El éxito de
la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a
mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las
condiciones ambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material
vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar
un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en
tierra.
¿En qué
consiste la selección de plantas madres?
Consiste en obtener el
material vegetativo para ser empleado en la siembra de los cultivos y que
logran ser plantas en producción de pimienta en parcelas de agricultores o
plantas preparadas exclusivamente para producir dicho material.
¿Qué es un explante?
Un explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de
la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces,
pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas
y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien
células individuales (como en el caso de los protoplastos3). Con excepción de los óvulos y el polen, los
explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.
Pasos requeridos
para la siembra de explante:
1.- Selección del mejor explante
2.- Desinfección del explante con soluciones
de hipoclorito de sodio y calcio, el peróxido de hidrogeno, el nitrato de
planta, el cloro comercial, el alcohol a diferentes porcentajes, y otros.
3.- Después de
desinfectar el explante se siembra en el medio de cultivo con ayuda las pinzas
procurando no introducir la mano al frasco y que la yema quede hacia arriba,
después de esto se cierra y se sella el frasco.
4.- El explante debe responder
eficientemente bajo condiciones in vitro. Es importante considerar el hecho de
que el aislamiento de un tejido u órgano del resto de la planta provoca un
estado de estrés que altera su metabolismo celular y en forma importante su
balance hormonal.
NOTA:
Un buen explante es aquella
cuyas células sobreviven en una alta porción, a la descomposición antes
señalada, y que luego responde eficientemente a las condiciones in vitro.
Las condiciones incubación de los cultivos se debe
llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo
que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad
atmosférica e higiene. Estas condiciones se
logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente
preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme
circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para
interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado.
- Asepsia
- Temperatura
- Luz
- Medio de cultivo
- Genotipo
- Efectos de posición y competencia
- Explante
Durante el período de incubación, los cultivos son
expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo.
El
trasplante al sustrato corresponde indicar que el trasplante de una
plántula in vitro a campo debe ser aclimatada, cuyo proceso regularmente dura
entre 4 y 8 semanas, esto consiste en el endurecimiento y adaptación de la
plántula al campo, lo cual debe ser de forma paulatina y secuencialmente:
1.- Elección de un
medio de enraizamiento de los explantes
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantones
individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la
fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas
especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el
mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso
de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.
2.- Aclimatación de los explantes enraizados
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios
ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de
la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo
que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
BIBLIOGRAFÍA
1. http://www.sian.info.ve/porcinos/eventos/clayuca0102/fenavi.htm
2. http://yactivany.blogspot.mx/2012/02/introduccion.html
3. http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm
4. http://www.scfarmclin.org/docs/higiene/part6/6.pdf
5. http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
6. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf
7. http://ocw.uniovi.es/file.php/57/practicas/Cuaderno_Pract_Biotec_11_OCW.pdf
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