jueves, 11 de abril de 2013

RESUMÉN REFERENTE A LA UNIDAD II DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA



El presente resumen corresponde a la materia de biotecnología aplicada, procedente a la unidad II Cultivos de tejidos vegetales. Su organización se ha conformado a partir del temario correspondiente a la asignatura. En cada uno de ellos se engloban temas y subtemas que se articulan posteriormente:


¿Qué es un medio de cultivo vegetal? Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento.
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.
Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente gelificantes como el agar.
 

Las áreas del laboratorio de cultivos vegetales., son aquellas que forman parte de la preparación de medios, cómo son:

1.    Área de preparación.
2.    Área de lavado y esterilización.
3.    Área de transferencia
4.    Área de incubación
5.    Área de observación y examen
6.    Área de crecimiento
7.    Área de cuarentena y de control fitosanitario   

El material y equipo de laboratorio a utilizar en la preparación de los medios de cultivos vegetales son:

  • Área de preparación de medios 
  • Área de oficina 
  • Área de esterilización 
  • Área de siembra 
  • Área de incubación
 
En este apartado se mencionaran algunas de las generalidades de los medios de
cultivo:



Los componentes de los medio de cultivo vegetal., son aquello (a) s:




Para la preparación y manejo de soluciones stock para el medio MS, se requieren de los métodos que se mencionaran posteriormente, los cuales se emplearan para la preparación de 4 reactivos que compone al medio de cultivo para la propagación de plantas in vitro.
  • Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)
  • Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)
  • Preparación de una solución stock de hierro MS x 200 (solución 3)
  • Preparación de una solución stock de vitaminas y inositol MS x 200  (solución 4)




Para la preparación de los medios de cultivo, se requiere de una formulación de datos adicionales para los medios:

CASO:

Preparar 500 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x, añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.

Fórmula para utilizar ciertos ml de la solución de 50x y verterlo para hacer 500 ml.







Después de haber agregado las 5 soluciones stock en el matraz. Se agrega después la sacarosa agregando 100 ml de agua, con forme se agrega la sacarosa. Después aforar a 500 ml, después se regula el pH entre 5.6 y 5.8 utilizando HCL o KOH para subir o bajar el pH. Después se agrega el Phytagel, se calienta a 40 °C, Aquí puede agregarse el Phytagel, se deja hervir por 2 minutos, después se saca y enfría poco a poco y se agrega a cada frasco con una cantidad a 20 ml.


¿Qué es la esterilización?

Es una serie de métodos físico-químico, que sirven para eliminar los microorganismos y esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivos.
También se le conoce como proceso de esterilización por medio del cual un material, superficie o sitio se libera de cualquier microorganismo o espora. 

Los métodos de esterilización comprenden entonces, todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos que se emplean para destruir gérmenes patógenos: Los más utilizados en la actualidad son los métodos físicos (calor, radiaciones, filtración, centrifugación) y los métodos químicos (agente químico).   

Cuáles son los factores que intervienen en el proceso de esterilización:

La eficacia de un proceso de esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí  y de múltiples factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de envoltorio, etc. Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza, preparación del equipo,  esterilización, almacenaje y transporte) deben validarse y controlarse;

1.    Factores relacionados con el objeto
2.    Limpieza del material previa a la esterilización
3.    Agua
4.    El detergente 

El establecimiento en el cultivo de tejidos vegetales consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio  nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas. 
La formulación del medio cambia  según  se quiera obtener  un  tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.
El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir,  que algunas  células  recuperen su  condición meristemática.
Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana opeperonias mediante porciones de hojas.




Las fases de Micropropagación en el establecimiento de los cultivos vegetales., constan de 4 periodos:

0 ELECCIÓN de la planta y/o tejido donante de explantes.
Particularidades:
1.- Sanidad
2.- Que sean plantas herbáceas
3.- Edad del explante
4.- Genotipo
5.- Época del año
6.- Edad de la planta
7.- Efecto posición y competencia

1 ESTABLECIMIENTO, que consiste en la desinfección de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior  adaptación al medio artificial de  modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee. 
2 MULTIPLICACIÓN, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de  plantas necesarias.
3 ENRAIZAMIENTO,  en la  que se busca la formación  de  raíces con el fin de convertir los brotes  o embriones somáticos en plántulas completas.
4 RUSTICACIÓN, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las  condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte).



El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad,  menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos, y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en tierra.  


¿En qué consiste la selección de plantas madres?

Consiste en obtener el material vegetativo para ser empleado en la siembra de los cultivos y que logran ser plantas en producción de pimienta en parcelas de agricultores o plantas preparadas exclusivamente para producir dicho material.

¿Qué es un explante?

Un explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos3). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.



Pasos requeridos para la siembra de explante:

1.- Selección del mejor explante
2.- Desinfección del explante con soluciones de hipoclorito de sodio y calcio, el peróxido de hidrogeno, el nitrato de planta, el cloro comercial, el alcohol a diferentes porcentajes, y otros.
3.- Después de desinfectar el explante se siembra en el medio de cultivo con ayuda las pinzas procurando no introducir la mano al frasco y que la yema quede hacia arriba, después de esto se cierra y se sella el frasco. 
4.- El explante debe responder eficientemente bajo condiciones in vitro. Es importante considerar el hecho de que el aislamiento de un tejido u órgano del resto de la planta provoca un estado de estrés que altera su metabolismo celular y en forma importante su balance hormonal.

NOTA:
Un buen explante es aquella cuyas células sobreviven en una alta porción, a la descomposición antes señalada, y que luego responde eficientemente a las condiciones in vitro.



Las condiciones incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado.
  1. Asepsia
  2. Temperatura
  3. Luz
  4. Medio de cultivo
  5. Genotipo
  6. Efectos de posición y competencia
  7. Explante

Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. 



El trasplante al sustrato corresponde indicar que el trasplante de una plántula in vitro a campo debe ser aclimatada, cuyo proceso regularmente dura entre 4 y 8 semanas, esto consiste en el endurecimiento y adaptación de la plántula al campo, lo cual debe ser de forma paulatina y secuencialmente:






1.- Elección de un medio de enraizamiento de los explantes
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantones individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.
2.- Aclimatación de los explantes enraizados
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.


BIBLIOGRAFÍA

1.       http://www.sian.info.ve/porcinos/eventos/clayuca0102/fenavi.htm
2.       http://yactivany.blogspot.mx/2012/02/introduccion.html
3.       http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm
4.       http://www.scfarmclin.org/docs/higiene/part6/6.pdf
5.       http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
6.       http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf
7.       http://ocw.uniovi.es/file.php/57/practicas/Cuaderno_Pract_Biotec_11_OCW.pdf

 

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