¶ ¶ ¶ ¶ ḼїδβӚϯЧ ᴙ ⱥ ¶ ¶ ¶ ¶: 4.4 REPLICACIÓN IN VITRO DEL ADN (PCR)

4.4 REPLICACIÓN IN VITRO DEL ADN (PCR)

PCR

* Reacción en Cadena de la Polimerasa.

Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.
El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

Fue diseñada por el Dr. KaryMullis en 1987.

Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.
Utilizo el PCR para amplificación del gen de b-hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

La PCR se realiza en un “ThermoCycler” Termociclador.
Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.
El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:

1.-Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

2. Apareamiento o “anneling”: Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.

3.-Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De esta forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde.