1.- INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR

1.- INTRODUCCIÓN A LA BIOLOGÍA MOLECULAR

El termino biología molecular fue utilizado por primera vez en 1945 por William Astbury para referirse al estudio de la estructura química y física de las macromoléculas biológicas.

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.

El origen de la biología molecular data de principios de

los años cuarenta. En aquel tiempo, los bioquímicos habían descubierto muchas reacciones químicas intracelulares fundamentales y habían comprendido la importancia de las reacciones específicas y de ciertas moléculas para definir numerosas propiedades de las células. Sin embargo, el desarrollo de la biología molecular tuvo que esperar a los adelantos que se llevaron a cabo estudiando células «sencillas» tales como bacterias y virus bacterianos (organismos procarióticos), los cuales proporcionan información acerca de los procesos biológicos básicos de una forma más rápida que las células animales (organismos eucarióticos). La creencia en la uniformidad básica de los procesos de la vida fue un factor importante en este rápido desarrollo1. Es decir, se pensó que los principios biológicos fundamentales que gobiernan la actividad de los
organismos procarióticos; podrían aplicarse también a los organismos eucarióticos, solamente variarían los detalles. Esta creencia ha sido posteriormente ratificada por los resultados experimentales. las bacterias y los virus permitieron a los científicos identificar un ácido nucleíco, el ácido deoxírribonucleíco o ADN, como la molécula que contiene la mayoría de la información genética de una célula y la que, a través de otro ácido nucleico -el ácido ríbonucleico o ARN-, controla gran parte de las funciones celulares, regulando la síntesis de otras moléculas, las proteínas. Después de este descubrimiento, el nuevo campo de la genética molecularavanzó rápidamente durante las siguientes décadas (tablaI), proporcionando nuevos conceptos a una velocidad que sólo puede compararse con la del desarrollo de la mecánica cuántica en los años veinte. Los últimos años están conociendo la aplicación creciente de la metodología de la biología molecular -la denominada tecnología del ADN recombinante- a la investigación de aspectos muy diversos tanto de la biología general como de la medicina y de otras ciencias.

Tabla I. Hitos históricos en el desarrollo de la biología molecular

• 1869 Miescher aisla por vez primera el ADN.
• 1944 Avery demuestra que durante la transformación bacteriana esel ADN, y no las proteínas, el que contiene la información genética.
• 1953 A partir de los estudios con rayox X efectuados por Franklin y Williams, Watson y Crick proponen que la estructura del ADN se asemeja a la de una doble espiral.
• 1957 Kornberg descubre la ADN polimerasa (enzima que sintetizaADN).
• 1961 Marmur y Doty desarrollan la técnica de hibridación del ADN.
• 1962 Arber descubre las nucleasas de restricción (enzimas que separanen fragmentos al ADN). Nathans y H. Smith usan esas enzimas para caracterizar la secuencia del ADN.
• 1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana descubren el código genético.
• 1967 Geller descubre la ADN ligasa (que une fragmentos de ADN).
• 1972-73 Boyer, Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación del ADN.
• 1975.77 Sanger y Barrell y Maxam y Gilbert desarrollan métodos de secuenciación rápida del ADN.
• 1981-82 Palmiter y Brinster desarrollan ratones transgénicos.

 

1.1 EL DESARROLLO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.

La Biología molecular aparece desde el descubrimiento de la doble hélice de ADN de Watson y Crick en 1953. Luego Francis Crick continúa con el descubrimiento del código genético en los 60′s. Es decir se descubrió que las bases del ADN se leen de a 3, y tres combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse como es la molécula de ADN y como lleva la información que contiene a la célula que la contiene. A esto se lo denominó “Dogma central de la biología molecular”.

Luego aparece el descubrimiento de las enzimas de restricción que permiten cortar el ADN y así analizarlo. Nace allí la ingeniería genética. Eso permitió cortar y pegar a la molécula de ADN para estudiarla, analizar patologías en ciertos genes, etc. Hasta que, hacia fines de los 80′s, Karl Mullis descubre la técnica de PCR que revolucionó a la genética por su paracticidad y rapidez para amplificar una region de ADN en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis.

 

1.1.1 El descubrimiento del principio transformante.

Como sabemos que los genomas están compuestos de DNA?

En el caso de los cromosomas nucleares eucarióticos, es relativamente sencillo demostrar este hecho mediante la utilización de pruebas histoquímicas y fisicas. Los colorantes que se unen al DNA, como Feulgen, tiñen principalmente los cromosomas nucleares y también mitocondrias y cloroplastos. Además si se fraccionan los componentes de una masa de células, se observa claramente que la mayor parte del DNA aparece en la fracción nuclear y el resto en las mitocondrias y cloroplastos.

Que el DNA es el material genético esta hoy día perfectamente demostrado en muchas procariotas y eucariotas. Pero  la demostración de ese hecho llevo a la realización de brillantes e ingeniosos experimentos.

 

·         EXPERIMENTOS DE GRIFFITH (1928) 

• El descubrimiento de la trasformación.

En 1928 en el transcurso de sus experimentos con la bacteria Streptococcus pneumoniae, Frederick Griffith había hecho una misteriosa observación. Esta bacteria humana causante de la neumonía humana, es normalmente letal para los ratones. Sin embargo, han aparecido diferentes cepas que difieren en su virulencia. Griffith utilizo en sus experimentos dos cepas que se distingan por la apariencia de las colonias crecidas en laboratorio. Las células de una de las cepas, de tipo virulento normal, están rodeadas por una cápsula de polisacáridos que le da a la colonia apariencia lisa (smooth en ingles); de ahí llamada estirpe S. Las células de la otra cepa (un tipo mutante) no virulento que se reproduce en los ratones pero no es letal, carecen de esta cápsula de polisacáridos, lo cual hace que las colonias tengan apariencia rugosa; esta es la denominada estirpe R.

 

Griffith mato algunas células virulentas, hirviéndolas e inyecto las células muertas en ratones. Los ratones sobrevivieron, demostrando así que las cápsulas de las células no provocan la muerte. Sin embargo, ratones inyectados con una mezcla de células no virulentas vivas y células virulentas muertas, murieron. Además podían recuperarse  bacterias vivas de los ratones muertos; esta producían colonias lisas y en subsiguientes inyecciones eran virulentas. De alguna manera, los restos celulares de las células S hervidas habían convertido a las células S vivas. Este proceso se denomina transformación.

 

Conclusión: Los experimentos de Griffith demostraron que la transformación ocurría por la absorción por parte de células vivas (estirpe R) de un “principio trasformante” que se encontraba en las células muertas (Estirpe S). Ese principio trasformante tenia la característica de producir una cápsula de polisacáridos (se expresaba) y producía además la muerte en ratones, en otras palabras estaban confiriendo propiedades hereditarias a la celula recipiente, ese principio trasformante se sabría después que eran moléculas de DNA.

 

·         EXPERIMENTOS DE AVERY Y COLABORADORES (1944)

Oswald Avery, Colin McLeod, Maclyn McCarty

 

Este mismo método básico se utilizó para determinar la composición  del “principio trasformante. En 1944, Oswald Avery, C. MacLeod y M. McCarty separaron los distintos tipos de moléculas que se encuentran en las células S muertas y estudiaron su capacidad de transformación por separado. 

Estas pruebas demostraron, en primer lugar, que los propios polisacáridos no trasformaban a las células rugosas. Por tanto la cubierta de polisacáridos, aunque claramente implicada en la acción patogénica, es solo la expresión fenotípica de la virulencia. Tras el escrutinio de los diferentes compuestos (Polisacáridos, Lípidos, RNA, Proteínas y DNA), Avery y col. Descubrieron que solo DNA, inducía la transformación de las células R, dedujeron que el DNA es el agente que determina la aparición del polisacárido y, por tanto, del carácter patogénico. Es mas, parece ser que proveer  a las células R del DNA de las células S es equivalente a ¡proveerlas de los genes de las células S!!

Conclusiones de Avery, McLeod y McCarthy: Teniendo en cuenta que la única fracción químicamente pura de los neumococos SIII muertos por calor que puede transformar los neumococos RII en SIII es el ADN, el Principio Transformante detectado por Griffith debe ser el ADN. Por tanto, la molécula responsable de convertir los neumococos no virulentos en virulentos es el ADN y, por consiguiente, en él debe residir la información genética.

EXPERIMENTOS DE HERSEY Y CHASE (1952) 

 

 

  

Alfred Hershey y Martha Chase

Los experimentos llevados a cabo por Avery eran definitivos, pero muchos científicos se resistieron a aceptar como material genético al DNA (y no a las proteínas). La prueba definitiva se obtuvo en 1952 por Alfred Hersey y Martha Chase, usando el fago (virus T2). su razonamiento fue que la infección del fago debe implicar la introducción dentro de la bacteria de la información que dicta la reproducción viral. El fago es relativamente simple en cuanto a la composición molecular.

Estructura y partes de un Fago T2

Los experimentos llevados a cabo por Avery eran definitivos, pero muchos científicos se resistieron a aceptar como material genético al DNA (y no a las proteínas). La prueba definitiva se obtuvo en 1952 por Alfred Hersey y Martha Chase, usando el fago (virus T2). su razonamiento fue que la infección del fago debe implicar la introducción dentro de la bacteria de la información que dicta la reproducción viral. El fago es relativamente simple en cuanto a la composición molecular.

La mayor parte de la estructura de un fago es proteína, estando el DNA en el interior de la envuelta proteica o “cabeza”. En las proteínas no se encuentra fósforo, que si forma parte del DNA; inversamente, el azufre esta presente e las proteínas pero nunca en el DNA. Hersey y Chase marcaron el DNA del fago con un radioisótopo del fósforo (P³²)  y las proteínas con azufre (S³⁵), en cultivos distintos de fagos. Usaron entonces cada cultivo por separado, para infectar E. coli con muchas partículas de virus por cada célula. Tras dejar tiempo suficiente para que se produjera la infección, separaron de las células bacterianas las carcasas vacías de los fagos llamadas “fantasmas” mediante agitación con una batidora de cocina. Separaron las células bacterianas de los fantasmas de los fagos, mediante centrifugación, y midieron entonces la radioactividad en las dos fracciones. Cuando se usaron los fagos con P³², la mayor parte de la radioactividad terminaba en las células bacterianas, indicando que el DNA viral entraba en las células. También podía recuperarse P³² de los fagos descendientes. Cuando se usaron fagos los fagos marcados con S³⁵, la mayor parte de la radiactividad terminaba en los fantasmas virales, indicando que la proteína viral nunca entra en la célula bacteriana.

La conclusión es evidente!: El DNA es el material hereditario; las proteínas fágicas son meros empaquetadores estructurales que se desechan después de inyectar el vital  DNA en la célula bacteriana.