10.7 TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
Uno de los más grandes avances
de la ciencia contemporánea ha sido el desarrollo de la ingeniería genética y
la biotecnología. Por medio de estas dos disciplinas –muy relacionadas entre
sí– se ha logrado manipular genéticamente a los individuos con el fin de
propiciarles nuevas características.
La tecnología del DNA
recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético
foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a
su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir
del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos.
Cuando se complementó el estudio de las enzimas de restricción con la
micromanipulación (conjunto de técnicas que permiten inyectar y succionar
porciones de una célula) se desarrolló esta nueva tecnología, que ha abierto
las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la genética molecular.
El principio de la
tecnología de DNA recombínate se basa en la inserción de un fragmento de DNA
foráneo en un hospedero de clonaje molecular
por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido. Una
vez que el fragmento de DNA foráneo se ha introducido en el hospedero, comienza
el proceso de clonaje molecular y la recombinación, dando como resultado la
expresión del gen o los genes introducidos en un organismo diferente.
En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de
DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de
vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y
ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades,
en el campo médico.
La ingeniería genética en plantas también ha
provisto la mejora de ciertas especies haciéndolas más resistentes o
introduciendo ciertas características de otros individuos para mejorarlas.
Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la
producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de
hidrocarburos, metales pesados como el mercurio. Las técnicas de bioremediación
permiten una descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de
microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han
empleado organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con
numerosas cepas modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los
contaminantes.
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PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
1.- PRODUCCIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA PARA RECOMBINACIÓN
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas
por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente
específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodíester de los
ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares
específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que
ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos
infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de
grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.
Tabla.
Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en
base a Griffith et al. 1998).
Las
enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases
nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de
restricción y producen dos tipos de corte:
1.- Corte con extremos cohesivos y
2.- Corte con extremos romos (ver Fig.) (Griffith
et al. 1998).
Fig. Producción de extremos (a) cohesivos y (b)
romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.
Otro método para
producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear
ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en
pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la
desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran
precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.
Algunas enzimas de
restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un
barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia
palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una
simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio
de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se
produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En
este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA,
leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto
comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.
Los
puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como
marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa
de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa
mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se
establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos
para cada molécula de DNA en estudio.
Los
extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA
recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es
más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por
complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas
denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser
usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser
más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la
adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos
cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento
no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.
Existe otro tipo de
enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las
cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra
de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas,
plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener
un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células
defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos
experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa,
Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae,
Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.
