10.6 POR MICROORGANISMOS (BACTERIANAS, PROTOZOARIOS, ENTRE OTROS)

10.6 POR MICROORGANISMOS (BACTERIANAS, PROTOZOARIOS, ENTRE OTROS)

La detección de moléculas de patógenos (antígenos y material genético) y moléculas de respuesta de los hospederos ante la infección (anticuerpos) es el principio básico de las pruebas diagnósticas moleculares. Estas pruebas han hecho innecesaria la detección directa del microorganismo patógeno agresor. Los nuevos avances en biología molecular y el desarrollo de tecnología robótica y secuenciación genómica y proteica han permitido el desarrollo de nuevas pruebas diagnósticas altamente específicas y de gran rendimiento. La genómica y proteómica contribuyen a la identificación de biomarcadores y la biotecnología aporta métodos para producir reactivos de alta pureza. La identificación de genes codificantes de antígenos específicos, su clonación y producción recombinante y la producción de anticuerpos monoclonales, fragmentos de éstos y anticuerpos de una sola cadena han hecho posible el desarrollo de nuevas técnicas inmunológicas más seguras y de sensibilidad y especificidad elevadas. Nuevas moléculas de reconocimiento, incluidos los aptámeros, podrán pronto superar la necesidad de producir anticuerpos mediante inmunización. Para la detección de material genético se han desarrollado nuevas medidas metodológicas basadas en la hibridación y amplificación (PCR, de punto final y en tiempo real) en formatos multiplex y en microarreglos y para su detección se han diseñado moléculas reporteras que permiten su cuantificación. Aunque estos métodos requieren instrumentación compleja, puede ya anticiparse que pronto serán accesibles para su aplicación en salud pública.

La eficacia de los métodos para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas depende de su sensibilidad y especificidad para la detección inequívoca de la presencia de organismos patógenos o la respuesta específica del hospedero infectado ante su presencia. Las nuevas tecnologías basadas en la biología molecular ha permitido la identificación de componentes (biomarcadores) exclusivos de los agentes infecciosos (bacterias, protozoarios, virus), moléculas que participan en la interacción de los patógenos con sus hospederos (de reconocimiento e interacción con sus células y organismos blanco, productos metabólicos y toxinas) y moléculas que producen los hospederos en respuesta a la agresión. Éstas pueden utilizarse para la detección e identificación, a nivel de grupo y especie, de los agentes agresores y son la base para el diseño de pruebas diagnósticas moleculares. Para este efecto, los nuevos desarrollos en biotecnología han posibilitado la ingeniería molecular de reactivos para pruebas que dependen de la interacción de moléculas de reconocimiento, la producción a gran escala de reactivos altamente purificados, el desarrollo de pruebas más sensibles con alta especificidad y la automatización de protocolos diagnósticos para el procesamiento simultáneo de un número grande de muestras, lo cual las hace útiles en estudios de salud pública.

 

• DETECCIÓN ESPECÍFICA DE MOLÉCULAS MEDIANTE PRUEBAS INMUNOLÓGICAS

Las pruebas inmunológicas están diseñadas para detectar antígenos circulantes de los patógenos o la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a agentes infecciosos. Algunas de las moléculas que participan en la interacción hospedero-parásito pueden permanecer en el suero de los sujetos infectados por periodos prolongados y son detectables aun en casos en los que la infección es asintomática y después de su resolución. La detección de estas moléculas, si bien no siempre es útil para identificar infecciones activas, lo es para determinar su frecuencia y el grado de dispersión de los agentes infecciosos en la población humana.

La detección de antígenos circulantes en una persona es prueba fehaciente de una infección activa o muy reciente; la presencia de anticuerpos específicos es evidencia de que el agente microbiano se encuentra o estuvo presente en ese individuo, por lo que su reconocimiento puede servir como prueba diagnóstica de una infección aguda o reciente (IgM), o bien de una infección pasada o crónica (IgG).

En la práctica, las mayores limitaciones para el diseño y desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico por métodos inmunológicos son la producción de antígenos y anticuerpos específicos para las moléculas de interés.

La producción de proteínas y secuencias nucleotídicas por medio de técnicas de biología molecular hace posible la obtención de reactivos de alta pureza en grandes cantidades. De manera adicional, la estructura de las moléculas producida por estas técnicas puede modificarse para incrementar su reactividad. La preparación de anticuerpos específicos requiere antígenos en cantidad y pureza suficientes. Si bien los antígenos proteicos pueden obtenerse directamente del organismo que se desea detectar en la prueba diagnóstica, el uso de moléculas producidas por metodología recombinante tiene varias ventajas: dado que se conoce la secuencia del gen y su producto correspondiente, es posible introducir en estas secuencias modificaciones que al cambiar algún grupo químico específico facilitan su purificación, o la hacen más antigénica y por tanto más eficiente para la producción de anticuerpos específicos. Además, la producción de antígenos por medio de tecnología recombinante permite aumentar la cantidad y pureza del antígeno producido, además de acelerar y disminuir los costos de producción. Por otra parte, los antígenos de microorganismos peligrosos pueden producirse en organismos inocuos, con lo que se reduce el riesgo de infección durante la producción.

Entre las pruebas inmunológicas más utilizadas en métodos diagnósticos figuran las de hemaglutinación, inmunodifusión e inmunofluorescencia indirecta (IFI); algunas de éstas constituyen las pruebas de referencia (“estándar de oro”) para la detección de agentes patógenos. En la actualidad se utilizan los métodos automatizados en cámaras de multipozos tipo ELISA y las pruebas rápidas (rapid diagnostic tests, RDT), en las cuales los antígenos a detectar se fijan a una tira de membrana que se sumerge directamente en los reactivos de detección (anticuerpos) y revelado, con obtención en pocos minutos de un resultado. Estas pruebas permiten procesar en forma expedita un número elevado de muestras, con buena sensibilidad y especificidad.

El análisis del desarrollo de pruebas rápidas (RDT) ejemplifica los procedimientos moleculares empleados para el diseño de nuevas técnicas inmunológicas, así como las ventajas y limitaciones de este tipo de pruebas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, incluidas malaria, SIDA y sífilis. Las RDT son tiras diagnósticas que tienen como principio la inmunocromatografía para identificar antígenos o anticuerpos; un reactivo (antígeno o anticuerpo) es reconocido por otro reactivo (anticuerpo o antígeno) contenido en un líquido que migra a través del papel. El objetivo de estas pruebas es contar con instrumentos diagnósticos que sean simples, con resultados inmediatos para el diagnóstico in situ (junto al paciente) y, de esa manera, poder instituir tratamiento oportuno (por tal razón se conocen como pruebas de punto de atención), y al mismo tiempo tomar decisiones acerca del control de la dispersión de los agentes patógenos.

Las tiras diagnósticas son producto de la aplicación de la biología molecular a varios niveles, la identificación de biomarcadores específicos, su clonación y producción por medio de tecnología recombinante y la producción de anticuerpos monoclonales para su captura y detección. El caso de las RDT para la detección de pacientes maláricos es un buen ejemplo. El diagnóstico de infección con el parásito de la malaria (Plasmodium spp.) se basa en la identificación de un biomarcador como la proteína rica en histidinas 2 (PRH2), la enzima deshidrogenasa de lactato (pLDH) o una aldolasa parasitaria. Las tiras diagnósticas contienen en su extremo distal anticuerpos monoclonales que reconocen pLDH o aldolasa, comunes entre las especies del parásito, pero todas contienen anticuerpos específicos contra P. falciparum, de tal modo que pueden servir para establecer diagnósticos diferenciales o de infecciones mixtas.

Para el diagnóstico se coloca en el extremo proximal de la tira la muestra sanguínea, junto con un amortiguador de lisis celular que contiene además un anticuerpo marcado con un colorante. La migración del líquido pone en contacto a los tres reactivos y la fijación en una banda del anticuerpo marcado (figura 1). La presencia de pLDH o aldolasa en la muestra sanguínea indica infección activa, pero la PRH2 persiste en circulación hasta por 14 días después del tratamiento, por lo que en ese caso puede tratarse de una infección resuelta o persistente. La sensibilidad de la prueba es de 95%, en comparación con un análisis por microscopia, con un límite inferior de 100 parásitos/μl. Sin embargo, existen variaciones regionales de HPR2, lo que hace que en algunas áreas la prueba genérica no reconozca parasitemias por debajo de 500 parásitos/μl.

Varias pruebas de la efectividad y el costo-beneficio de las RTD se han realizado en varias partes del mundo. Por ejemplo, debido al aumento de la resistencia de los parásitos del paludismo a los medicamentos anti-maláricos, se han introducido nuevos esquemas de tratamiento con combinaciones farmacológicas que requieren una evaluación oportuna de su efectividad; para ello las RTD proporcionan ventajas en relación con el manejo rápido y masivo de muestras para la detección parasitaria.

La disponibilidad de aparatos robóticos ha posibilitado la manipulación automatizada de cantidades muy pequeñas de reactivos y la fijación de moléculas reactivas (ácidos nucleicos, proteínas o azúcares) en hileras, muy próximas entre sí, sobre una matriz sólida plana (una membrana o un vidrio), lo que se denomina microarreglos (figura 2). Para el desarrollo de pruebas diagnósticas existen dos tipos de microarreglos de proteínas: los que contienen fijados en la matriz sólida anticuerpos para la detección de diversos antígenos (biomarcadores de patógenos) y los que contienen antígenos específicos de los patógenos para la detección de anticuerpos en muestras sanguíneas. Un ejemplo de estos últimos se desarrolló para la detección simultánea de anticuerpos en sueros humanos contra Toxoplasma gondii, el virus de la rubeola, citomegalovirus y el virus del herpes simple tipos 1 y 2. El desempeño diagnóstico de estos microarreglos se comparó con el de una prueba ELISA comercial, lo cual puso de manifiesto las ventajas de este tipo de pruebas de alto desempeño respecto de las técnicas inmunológicas tradicionales: ambas pruebas pueden utilizarse para el diagnóstico de infecciones recientes (detección de IgM), pero en los microarreglos, además de la investigación simultánea de varios patógenos, la reproducibilidad de los resultados es mayor, se utilizan cantidades de reactivos menores y, por último, la incorporación de curvas de calibración en la matriz permite que ésta se procese bajo las mismas condiciones que las muestras, de tal modo que se eliminan las variaciones debidas al tiempo de manipulación, temperatura, contenido de grasa, proteínas, y otros factores, en los sueros problema.

• INGENIERÍA MOLECULAR DE ANTICUERPOS

Los anticuerpos se unen con alta especificidad y sensibilidad a proteínas, azúcares, lípidos y moléculas diversas; en consecuencia, usados como reactivos, pueden identificar de forma eficaz una gran variedad de biomarcadores de agentes patógenos. No obstante, éstos presentan algunas dificultades de producción e inconvenientes para las aplicaciones biotecnológicas. Por consiguiente, la producción tradicional de anticuerpos contra el antígeno deseado, por medio de inmunizaciones de animales, no siempre es exitosa; asimismo, es posible que la especificidad y la sensibilidad de los anticuerpos producidos puede ser limitada por las características genéticas de la especie animal utilizada. Si bien la tecnología recombinante ha revolucionado la producción, diseño y adecuación para funciones específicas de proteínas, la estructura de los anticuerpos formada por dos cadenas pesadas y dos ligeras dificulta su producción por medio de esta tecnología. Además, estas moléculas requieren modificaciones postraduccionales, como glucosilación, doblamiento y formación de puentes disulfuro, lo que impide su producción en forma recombinante en organismos procariontes. La metodología para la preparación de anticuerpos monoclonales revolucionó la producción de anticuerpos, ya que hace posible obtener anticuerpos dirigidos contra un solo epitopo, se pueden almacenar las células para volver a elaborarlos cuando sea necesario y se pueden producir cantidades suficientes de reactivos. No obstante, esta medida es todavía costosa y encarece su inclusión en pruebas diagnósticas.

Varias intervenciones moleculares se han empleado para resolver las limitaciones de producción y el diseño de anticuerpos con mayor afinidad por sus antígenos y estructuras más sencillas y estables. Las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) que conforman los anticuerpos pueden producirse de manera aislada y conservar su capacidad de unirse de manera específica a sus antígenos, pero con afinidad y solubilidad reducidas. Las moléculas que contienen aparejadas las regiones complementarias (CDR) de las cadenas VH y VL son suficientes para mantener su unión específica a los antígenos. Los métodos de biología molecular se emplean para generar proteínas semisintéticas derivadas de los anticuerpos, estructuralmente más sencillas, que incluyen las regiones variables funcionales, con capacidad de unión a un antígeno y estables en diversas condiciones ambientales; entre éstas figuran las siguientes: fragmentos ab (Fab); fragmentos variables (Fv); y regiones variables conformadas con una sola cadena (scFv). Estas moléculas se producen como fragmentos Fab de anticuerpos monovalentes, como cadenas únicas (SCFv) que contienen las regiones VH y VL unidas por un polipéptido puente y que mantienen su funcionalidad, como por ejemplo su capacidad de inhibir el desarrollo de patógenos. Las moléculas formadas por un solo dominio variable (VHs) se pueden diseñar por computadora para hacerlas complementarias a la estructura de su molécula blanco. También se producen fragmentos correspondientes a las regiones variables de los anticuerpos conformados con dos cadenas peptídicas ensambladas en una sola cadena peptídica (dsFv). Algunas de estas variantes de anticuerpos se producen a gran escala en organismos modelo como Escherichia coli o sistemas de virus, procariotes y eucariotes. La producción de fragmentos de proteínas en bacteriófagos filamentosos de tipo f (fagos f1, fd y M13) también se ha empleado para la elaboración de scFvs, para cuyo fin se clona el fragmento de interés para producirla fusionada con una proteína de cápside expuesta en la superficie del virión (phage display) (figura 3). Los fagos son muy convenientes para expresar dominios de anticuerpos, ya que son estables en forma cristalizada o liofilizada y ello facilita su almacenaje y transporte y se pueden producir en gran cantidad y a bajo costo. Ejemplos de la aplicación de esta tecnología son la producción de fagos capaces de identificar antígenos de bacterias del género Bacillus spp., incluido B. anthracis, los cuales tienen alto potencial para diagnóstico ya que son específicos y sensibles y se pueden manipular en diversas plataformas de ensayos diagnósticos  y se experimenta con fagos útiles para la neutralización de ataques terroristas, ya que se ha demostrado que la inmunización pasiva tiene efectos significativos en el tratamiento.

 

Una alternativa para la producción de nuevos reactivos de reconocimiento es la ingeniería de moléculas (proteínas y otras moléculas) diferentes de las Igs, con capacidad de unirse de manera específica a un antígeno. Una ventaja adicional de estos moldes es que pueden generarse moléculas que no tengan reacciones inmunitarias cruzadas y que para el revelado de sus pruebas no dependan, a su vez, de segundos anticuerpos que puedan presentar reconocimiento cruzado. Entre estas moléculas se encuentran las proteínas ricas en leucina, lipocalinas y tendamistat.

Por otra parte, por medio de la síntesis química de oligonucleótidos, se generan moléculas de ARN y ADN (genes sintéticos), con propiedades de reconocimiento altamente específico de moléculas que en algunos casos es superior al de los anticuerpos. Los aptámeros son muy estables ante condiciones ambientales, pueden producirse contra moléculas poco inmunogénicas y su afinidad y especificidad de unión a los antígenos pueden mejorarse clonando los aptámeros como genes sintéticos y la introducción dirigida de variaciones en su secuencia “evolución dirigida”. Por otra parte, durante la síntesis de los aptámeros se pueden introducir átomos que funcionan como etiquetas para su detección como los quantum dots (Q-dots) y al aplicarse se puede inducir su unión covalente al sitio blanco, lo que permite que el complejo aptámero-molécula blanco pueda lavarse en condiciones extremas, antes de su lectura, para mejorar la especificidad y estabilidad de las pruebas diagnósticas. Los aptámeros son eficientes en pruebas y formatos bien establecidos y pueden competir con los anticuerpos en diagnóstico e investigación.

• BIOLOGÍA MOLECULAR DE ÁCIDOS NUCLEICOS Y MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

Si bien los organismos comparten de manera variable en su genoma genes comunes (ortólogos), estos genes y otros no compartidos presentan secuencias específicas de género, especie y cepa que hacen posible su identificación inequívoca. Una vez identificadas las secuencias exclusivas de patógeno, éstas pueden utilizarse para el desarrollo de reactivos para pruebas diagnósticas. En la práctica se desarrollan de forma constante nuevos equipos para la manipulación, secuenciación y detección de ácidos nucleicos, lo que permite que esté en desarrollo una gran cantidad de proyectos de secuenciación de genomas de microorganismos; de igual modo, muchas de las bases de datos generadas, completas o en proceso, y las herramientas informáticas para su análisis están disponibles libremente en internet (Portal NCBI National Institute for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes/). También están disponibles bases de datos con información sistematizada sobre microorganismos con potencialidad patogénica, según sean la agresividad, potencialidad de dispersión, datos epidemiológicos y técnicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas; estas bases de datos se pueden consultar en línea (http://www.cdc.gov/page.do) (cuadros I a III).

• DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

 

La detección del material genético de un microorganismo en muestras biológicas indica la presencia del patógeno en los sujetos de estudio en el momento de obtener la muestra. Esta detección permite la identificación de infecciones de manera directa sin la necesidad del cultivo del agente patógeno causal y la detección de ARN mensajeros indica que el organismo en cuestión está metabólicamente activo. Las pruebas diagnósticas basadas en ácidos nucleicos se basan en la detección directa de su presencia por medio de sondas específicas (hibridación), pero también es posible incrementar su sensibilidad por medio de la amplificación de secuencias específicas diagnósticas (reacción en cadena de la polimerasa) del material genético presente en las muestras.

La hibridación se basa en la capacidad de dos cadenas sencillas de ácido nucleico, ADN o ARN, complementarias en su secuencia de bases, de formar enlaces específicos y crear una doble hélice en cualquier combinación: ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. Durante la hibridación una molécula de secuencia conocida (la sonda diagnóstica) “busca” e identifica a su complementaria en una mezcla de moléculas de ácido nucleico, aunque ésta sea muy compleja. La hibridación se puede efectuar en diversos formatos, en solución o con la cadena blanco unida a un soporte sólido o incluso in situ, esto es, en un corte de tejido o un microorganismo completo fijado. La sonda diagnóstica puede producirse por síntesis química o técnicas recombinantes y durante su producción se le incorporan etiquetas para su detección (enzimas para detección colorimétrica, fluorescencia). El número de moléculas blanco presentes en la muestra determina el número de moléculas de la sonda que se fijan al formato, lo cual determina la intensidad de la señal. La especificidad de la señal obtenida depende del grado de complementariedad entre las dos cadenas de ADN (la sonda y el gen investigado) y su sensibilidad (que se limita al número de copias del gen investigado en el material biológico).

En formato individual, la hibridación es útil para detectar o confirmar los resultados de otras pruebas.

Nuevos desarrollos que usan el principio de hibridación son los microarreglos. En este formato, las sondas de ADN se imprimen o sintetizan (con formación de celdas) por medios automáticos directamente sobre soportes sólidos de vidrio o polipropileno y estas secuencias, fijadas en el soporte sólido, se incuban con muestras que contienen el material genético en estudio, previamente marcado, de tal modo que al hibridarse se presenta una señal en la celda reconocida.

En el momento presente, los altos costos de los métodos basados en microarreglos impiden su empleo en estudios poblacionales; no obstante, esta técnica se ha utilizado para estudios epidemiológicos que incluyen números pequeños de muestras, como la genotipificación de cepas de virus de la inmunodeficiencia humana resistentes a tratamiento, y para determinar el origen de infecciones sintomáticas y asintomáticas con poliovirus en una población previamente vacunada.
 

•  PCR

 

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento muy sensible que utiliza una polimerasa de ADN; este procedimiento permite amplificar y detectar de manera específica, a partir de una sola molécula blanco, secuencias particulares de ADN. La reacción depende de oligonucleótidos cortos (cebadores o sondas) que tienen la secuencia adecuada (complementaria) para hibridar en los extremos de cadenas sencillas del ADN blanco, las cuales se obtienen mediante la desnaturalización del ADN original. Una vez unida, la sonda sirve como ancla para que la polimerasa inicie la producción de la cadena complementaria a la secuencia blanco, de tal manera que se forman moléculas de ADN de doble cadena. La desnaturalización de este ADN, la hibridación con la sonda y la síntesis de la cadena complementaria con ciclos repetidos permiten la obtención de grandes cantidades de ADN específico del microorganismo investigado, lo cual facilita su detección. El reconocimiento del material producido se obtiene mediante electroforesis en geles de agarosa y la identificación de bandas del tamaño molecular esperado por medio de tinción con bromuro de etidio. La sensibilidad y especificidad de la PCR han permitido el desarrollo de métodos diagnósticos para una gran variedad de agentes infecciosos: bacterias, protozoarios, virus y helmintos. La prueba de PCR descrita se conoce como de “punto final”, ya que la reacción se detiene hasta que todos los reactivos necesarios para la amplificación se han utilizado. A partir del método básico de PCR se han desarrollado variantes para detectar ADN o ARN, con objeto de hacerlo cuantitativo (véase más adelante) y aplicar sistemas diagnósticos automatizados que realizan el procesamiento de las muestras desde la purificación del material genético hasta su análisis.

Existen numerosas pruebas diagnósticas que usan la PCR con el formato de “punto final”; en éstas, la reacción se realiza en un número predeterminado de ciclos y los productos se analizan por electroforesis. Por ejemplo, las especies de Corynebacterium: C. diphteriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis, son patógenas sólo cuando producen la toxina diftérica, para lo cual necesitan copias completas del gen tox. Mediante pruebas de PCR se puede reconocer la presencia del gen aun en muestras de pacientes que han recibido antibióticos, en quienes ya no es posible cultivar la bacteria. Sin embargo, en algunas cepas que poseen el gen tox, debido a mutaciones en la región de control del gen, éste no es activo, por lo que los pacientes positivos por PCR aún se los considera como casos presuntivos.

La PCR de punto final también se usa para el diagnóstico y clasificación de los parásitos del género Leishmania spp., los cuales poseen una mitocondria modificada llamada cinetoplasto en la que existen dos tipos de moléculas de ADN, los maxicírculos y los minicírculos. En la secuencia de los minicírculos, se presentan regiones conservadas y variables, entre las cuales se encuentran algunas específicas de especie/aislado (oxidasa de citocromo y regiones espaciadoras intergénicas), a partir de las cuales se pueden diseñar pares de oligonucleótidos iniciadores que al amplificar permiten distinguir entre géneros, especies y poblaciones de parásitos. Este método se puede aplicar a diferentes tipos de muestras, como sangre o aspirados de nódulos linfáticos, y en la actualidad se ha probado para la evaluación de la efectividad de nuevos fármacos, la identificación de portadores asintomáticos y de animales que sirven como reservorios en la naturaleza.

En la PCR multiplex se incorporan a la reacción de amplificación más de un par de sondas específicas para diferentes secuencias blanco. Los fragmentos generados pueden reconocerse por su tamaño o por medio de marcadores incluidos en las sondas. Entre las aplicaciones de este sistema figuran el análisis de muestras en las que hay varias moléculas blanco del mismo organismo, la confirmación de que éste se halla presente, o bien la investigación de forma simultánea de varios patógenos, para lo cual se incluyen sondas específicas para cada microorganismo. La dificultad principal de la PCR multiplex es el diseño adecuado de los oligos con el fin de evitar interacciones inespecíficas entre ellos y reconocimientos cruzados y lograr que los amplicones resultantes se puedan diferenciar unos de otros. Para el diseño de estos cebadores se han desarrollado programas computacionales que incluyen como elementos de selección secuencias específicas de los patógenos en estudio y composición de éstos para que los procesos de amplificación requieran las mismas condiciones (temperatura de “fusión”). De esta manera se genera un “sistema de tubo único”, en el cual se coloca la muestra en un tubo que se cierra con los reactivos de purificación y amplificación y ya no se abre sino hasta obtener el resultado, lo cual reduce el riesgo de manipular muestras peligrosas.

Para la identificación de los productos amplificados se han propuesto varias alternativas, además del uso de la electroforesis en agarosa. En un sistema para la detección de productos de PCR en una reacción multiplex, los oligos iniciadores se acoplaron a microesferas, de tal modo que los productos quedaron acoplados a éstas y eran distinguibles en un citómetro de flujo, lo que permitía la automatización de la lectura y la distinción de hasta de 80 blancos diferentes en una reacción. De la misma forma, los oligos pueden acoplarse a moléculas de tamaño diverso disponibles en el comercio (Qiagen Masscode Technology, Qiagen, Hilden, Alemania), con capacidad de distinguir hasta 64 diferentes tamaños y por tanto el mismo número de secuencias específicas. Otra manera de identificar productos diferentes en una PCR multiplex consiste en utilizar oligos marcados con faros moleculares (beacons, véase más adelante), los cuales emiten señales fluorescentes a distintas longitudes de onda.  Las pruebas basadas en la PCR multiplex son útiles para reconocer infecciones por patógenos que comparten cuadros sintomáticos comunes; con este propósito se diseñó una prueba para investigar la causa de las fiebres virales hemorrágicas, que incluye sondas para identificar 10 diferentes virus.

Para mejorar la sensibilidad en los ensayos multiplex se aplica también el principio de las reacciones “anidadas”, en las cuales la reacción se realiza primero con un juego de iniciadores “externos”, que en los primeros ciclos genera un fragmento “grande”. En una segunda etapa, el producto de la primera ronda de amplificación se convierte en el molde con un segundo juego de iniciadores que se hallan dentro del producto primario (“anidados”), lo cual asegura la especificidad del amplificado de la primera ronda.

 

• PCR EN TIEMPO REAL

 

Los “puntos finales” de las reacciones de PCR varían entre las muestras debido a la cantidad de ADN blanco presente en éstas. Además, el punto final es difícil de precisar ya que la amplificación, después de una fase exponencial, alcanza una meseta en la que los reactivos comienzan a agotarse. Estas condiciones son determinantes de las limitaciones de este método, entre ellas bajas precisión y sensibilidad, además de que no puede ser cuantitativa. En los métodos de PCR “en tiempo real”, las moléculas del fragmento blanco que se amplifican se detectan al mismo tiempo que se generan (durante la fase exponencial de la amplificación), con base en varias estrategias que dependen de moléculas fluorescentes (fluoróforos) cuya emisión es proporcional al número de moléculas producidas, lo que permite hacer la prueba de forma cuantitativa. Un fluoróforo es una molécula que absorbe radiación de una longitud de onda determinada (luz UV o láser) y luego emite la energía absorbida en forma de luz de una longitud de onda determinada, pero diferente a la empleada para su excitación; esto hace posible su identificación. La utilización de fluoróforos también permite realizar reacciones de amplificación multiplex y detectar cada molécula blanco con un fluorocromo diferente.

El método más sencillo de detección de los productos de PCR en tiempo real es la aplicación de un fluoróforo marcador, como el SYBRgreen, el cual emite fluorescencia cuando se intercala en el surco mayor de la doble hélice del ADN. Otra forma de reconocer productos de PCR en tiempo real consiste en usar los beacons (“faros moleculares”). En este sistema se generan sondas que poseen un fluoróforo “principal” en el extremo 5´ y otro fluoróforo de menor intensidad en el extremo 3´ con diferente espectro de emisión (beacons). Cuando estas sondas se encuentran como moléculas únicas se pliegan sobre sí mismas y la proximidad de los fluoróforos genera el efecto “FRET” (fluorescence resonance energy transfer), en el cual el fluoróforo secundario apaga la emisión del primario. Al ocurrir la reacción de PCR, el beacon forma parte de las moléculas amplificadas, con lo que el fluoróforo principal se separa del secundario y recupera su fluorescencia, de tal manera que la población de híbridos se puede medir porque su número es directamente proporcional a la magnitud de la fluorescencia. Los beacons pueden prepararse con diferentes fluoróforos, como SYBRgreen™, fluoresceína (FAM), Texas red, Rhodamina 6G, Cy3, Cy5, entre otros, y DABCYL como apagador, lo que posibilita realizar combinaciones para la detección multiplex.

 
En un ejemplo de aplicación se investigó en muestras sanguíneas humanas la presencia de los genes gag de HIV-1, env HIV-2, tax del virus T-linfotrópico tipo 1 y pol del tipo 2, mediante los juegos de beacons correspondientes, marcados con diferentes fluoróforos; esto permitió determinar la carga viral en las muestras; el método es rápido, sensible, específico y seguro para el operador.

En la PCR llamada TaqMan™ además del efecto FRET se utilizan las actividades de la polimerasa Taq, que actúa como polimerasa en dirección 5´>3 y como exonucleasa en dirección 3´>5´ (figura 4). A diferencia de la reacción de la PCR estándar, en el TaqMan se lleva a cabo una hibridación con una sonda complementaria de una región interna de la secuencia blanco, antes de la amplificación. La sonda interna tiene una temperatura de “fusión” 10°C superior a la de los iniciadores en los extremos y posee en su extremo 5´ un fluoróforo verde (6-carboxifluoresceína, FAM), cuyo espectro de emisión está “apagado” (quenched) por la proximidad espacial de un segundo colorante fluorescente. En una reacción de PCR, el primer paso de cada ciclo es un aumento de la temperatura para la desnaturalización de las cadenas de ADN, seguido de un descenso de la temperatura para la renaturalización, durante la cual se unen los iniciadores a los lados de la secuencia blanco. En la reacción TaqMan, durante la renaturalización la sonda TaqMan, en virtud de su afinidad mayor, se une a su sitio blanco antes de que lo hagan los iniciadores de amplificación. Para la fase de síntesis los iniciadores se unen, empieza la conformación de moléculas de ADN y durante el avance de la polimerasa Taq, ésta “choca” con la sonda y por su actividad de exonucleasa la degrada (se “come la sonda”, de tal modo que el fluoróforo de la sonda se libera y la señal se activa, lo que posibilita su medición. Se han publicado varios ensayos diagnósticos con base en este método, como el descrito para reconocer Chalmydia trachomatis y tuberculosis.En este tipo de prueba también se pueden hacer combinaciones de juegos de iniciadores y sondas con fluoróforos que emitan a distintas longitudes de onda para identificar varios blancos en reacciones multiplex. El sistema Scorpions es similar al anterior en tanto que incluye el juego de fluoróforos, principal y apagador, y el uso de un iniciador para la reacción de PCR, pero con la incorporación covalente de una secuencia adicional formada por un “bloqueador” en la región 5´; empero, a diferencia del anterior, no hay degradación de moléculas. En este formato se han diseñado métodos diagnósticos, como los descritos para Helicobacter pylori  y Micoplasma.

En el mercado ya están disponibles varios estudios diagnósticos basados en la reacción de PCR en tiempo real [sistema Roche Amplicor, éstos se someten de forma continua a evaluaciones y comparaciones con nuevos productos, aún no comerciales. Por ejemplo, la prueba PCR para Mycobacterium tuberculosis usa como blanco de amplificación una región del ARN ribosomal 16S de la micobacteria, con una sensibilidad de 47 a 58.2% y especificidad de 94 a 97%, según sea el tejido del que se obtiene la muestra. La sensibilidad varía con el tratamiento usado para purificar el material genético y, aunque esta prueba fue superior a los métodos tradicionales, todavía se identificó a un grupo de pacientes en el que no pudo establecerse un diagnóstico definitivo.

• ESPECTROMETRÍA DE MASAS Y DIAGNÓSTICO

En la actualidad, los métodos de espectrometría de masas (MS) disponibles permiten identificar moléculas orgánicas e inorgánicas de forma rápida, confiable y con alto rendimiento. La identificación de proteínas por MS es paralela a la acumulación de secuencias de ácidos nucleicos (genómica) y su control por bioinformática para conocer las proteínas codificadas por ellas y con estas proteínas virtuales hacer experimentos in silico, consistentes en la predicción de los iones que se generan durante la fragmentación en los diferentes sistemas de análisis. En una sola ronda de fragmentación/separación de iones se obtienen “huellas digitales” (gráfica de valores de masa/carga de los iones, m/z), que permiten identificar a la molécula exacta por comparación con las huellas digitales generadas teóricamente a partir de las bases de datos genómicas. Con estos estudios es posible identificar biomarcadores de patógenos específicos. La MS también puede usarse para identificar secuencias de ADN, lo que permite emplearla para el análisis automatizado y rápido de productos de PCR. Esta aplicación es útil en ensayos de PCR multiplex, como en el sistema denominado Masstag-PCR, en el cual los oligos para realizar la PCR se marcan con grupos químicos de masa conocida (MassTag) y la cantidad de los productos generados durante la amplificación se mide mediante un sistema de espectrometría de masas en fase líquida por la cantidad de las “etiquetas” incorporadas.  Esta técnica se ha aprobado para el diagnóstico diferencial e identificar hasta 22 agentes patógenos de muestras clínicas causantes de enfermedades respiratorias y virales hemorrágicas, con sensibilidad y especificidad elevadas.