sábado, 19 de mayo de 2012

8.2 REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN ORGANISMOS PROCARIÓTICOS


8.2 REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN ORGANISMOS PROCARIÓTICOS

 
Cuando las condiciones de crecimiento son tan pobres que faltan aminoácidos para la síntesis de proteínas, la respuesta estricta inhibe la síntesis de rRNA y tRNA 10 a 20 veces, y unas 3 veces la de mRNA, además de reprimir la síntesis de proteínas y algunas rutas anabólicas. La falta de aminoácidos la detecta relA que se encuentra en uno de cada 200 ribosomas. Esta proteína cataliza las reacciones: 

ppG (GDP) + ATP --> ppGpp + AMP
pppG (GTP) + ATP --> pppGpp + AMP

Cuyo fin es la síntesis de la señal (los tetra- y pentafosfato de guanosina) que desencadenará esta respuesta. La señal desaparece por la acción de spoT.

  •  CAMBIOS EN LA ESTRUCTURA DE LA RNA-POLIMERASA

El intercambio de factores? hace que la polimerasa reconozca distintos tipos de promotores.


  • CAMBIOS EN LA ESTRUCTURA DEL DNA

Metilación

La metilación provoca un cambio de estructura en el apareamiento entre las bases nitrogenadas que puede alterar su reconocimiento por algunas proteínas. El más conocido es el de la metilasa dam que reconoce la secuencia GATC y metila la A.

La mayor parte de los genes cuya expresión se ve reprimida por la metilación son genes cuya expresión sólo se necesita durante la replicación (único momento en el que una cadena del DNA está transitoriamente hemimetilado), permaneciendo reprimidos el resto del ciclo celular.

Los genes mioC y dnaA de E. coli implicados en el inicio de la replicación del DNA son de los pocos que se activan con la metilación, puesto que si el DNA está totalmente metilado, es señal de que se pueden expresar para iniciar otro ciclo replicativo.


Superenrollamiento

Para mantener una situación homeostática en la célula en relación al número de superenrollamientos es necesario mantener con una regulación contraria los genes topA (codifica la topoisomerasa I) y gyrA y gyrB (determinan las dos subunidades de la DNA-topoisomerasa II). No se conoce el mecanismo molecular que controla esta regulación. Sí se sabe que mutantes en las topoisomerasas disminuyen la tasa general de transcripción. 


  • CAMBIOS EN LA INTERACCIÓN ENTRE EL DNA Y LA RNA-POLIMERASA

Lo provocan aquellos cambios que, sin alterar ni la estructura del DNA ni la de la RNA-polimerasa, sí que afectan la interacción entre ambas. Es necesaria la comparecencia de una tercera molécula, habitualmente una proteína (aunque a veces puede ser RNA). Tres mecanismos pueden alterar esta interacción: 

1.- Modificación de la interacción entre RNA polimerasa y el promotor debido a la  existencia de una proteína reguladora y un efector.

2.- Secuencias reguladoras a distancia.

3.-Modificación de la terminación: antiterminación.


Operón lactosa

Fue el primer operón descubierto y quizá el mejor conocido. Está compuesto por un gen regulador I y los genes estructurales Z, Y y A. Se activa por la presencia de un inductor (natural como lactosa o alolactosa, o sintético como el IPTG), mientras que lacI actúa como  gen represor. El control que ejercen ambos puede activar o reprimir la transcripción del operón. Con la 3ª edición de —Lehninger Principios de Bioquímica— se distribuye una guía para conocer mejor la estructura del represor LacIp; es aconsejable visitarla. Este operón también puede sufrir una activación con el gen CRP , pasando a formar parte del regulón de la represión catabólica. La proteína reconoce el DNA gracias a un  dominio hélice-giro-hélice  (HTH por Helix-Turn-Helix) muy abundante en procariotas. Este activador dimeriza en presencia de cAMP.

La se establece a través de una estructura del tipo «cremallera de leucinas» que se verá más adelante. Restablecer aspecto inicial.

Su unión al DNA provoca una torsión en el mismo, lo que facilita el reconocimiento del promotor por la RNA-polimerasa. Compruébalo seleccionando en el menú Jmol «Select->Mouse Click Action->Angle» y pincha sobre un extremo del DNA, un punto central y el otro extremo. En la barra inferior de la ventana te devolverá un ángulo en torno a 120°. Todos los promotores reconocidos por CRP carecen de una buena secuencia -35 (y en algunos casos tampoco la -10), por lo que quizá la presencia de CRP pueda sustituir una reacción eficaz entre la RNA-polimerasa y la región -35. CRP interacciona con la subunidad α de la RNA-polimerasa. Además, mientras LacIp esté unido a su operador, el promotor no funcionará aunque tenga unido CRP. Y el promotor que no tenga LacIp unido no funcionará a menos que CRP se una a su operador.

Se utilizan corrientemente una serie de mutaciones del operón lac con interés biotecnológico, que son: 

1.- Mutación M15: afecta a los aminoácidos N-terminales 11 a 41 del gen lacZ. Estos mutantes son inactivos, pero pueden recuperar su actividad en presencia de péptidos con los 75 primeros aminoácidos de LacZ (complementación α). Esto lo utilizan los sistemas de clonación que identifican los transformantes por el color azul/blanco en presencia de X-Gal.

2.- Mutación lacUV5: cambia dos pb en la región -10 del promotor del operón que le adapta la secuencia al consenso perfecto de la región -10. El promotor se vuelve mucho más activo que el tipo silvestre, y es independiente de la activación por CRP. Se emplea en sistemas de clonación o expresión constitutiva que no hay que inducir con IPTG.

3.- Mutantes lacOc: mutaciones en el operador que lo hace irreconocible por LacIp, de manera que se expresan constitutivamente, sin necesidad de inductor.


Operón triptófano y atenuación

La estructura y regulación del operón muestra que la molécula  correpresora  es el triptófano, que junto a trpR (el gen regulador) reprimen la expresión del operón. Además, este operón es un claro ejemplo de regulación utilizando el acoplamiento entre transcripción y traducción que hay en procariotas. Este fenómeno se denomina  atenuación, cuyo modo de acción se basa en la formación de estructuras en horquilla implicadas en la terminación prematura del transcrito. La disponibilidad o no de triptófano (por ende, Trp-tRNATrp) es la que va a permitir que el operón se transcriba totalmente (ausencia de Trp) o que en presencia de Trp cualquier transcripción iniciada se aborte por la formación de una horquilla terminadora intrínseca en la región TrpL.


Regulación de las fases lítica y lisogénica del fago lambda

El sistema regulador temprano de este fago es mucho más complejo que los anteriores, ya que intervienen varios genes. Del fino equilibrio entre los represores cI y Cro va a depender que se entre en un ciclo lítico o en un ciclo lisogénico. El dominio de unión al DNA es también de tipo HTH en ambas proteínas. 

A diferencia de lo que ocurría con CRP, Cro no provoca ninguna torsión en el DNA al unirse a él. Compruébalo seleccionando en el menú Chime «Select -> Mouse Click Action ->Angle» y pincha sobre un extremo del DNA, un punto central y el otro extremo. Está claro que la distancia entre los dos dominios HTH que interaccionan con el operador va a determinar el grado de torsión del DNA unido. 

Una de las principales peculiaridades de esta regulación es la existencia de dos promotores solapados en sentido opuesto (PR y PRM) que comparten las mimas señales de regulación: los operadores OR1, OR2 y OR3.




El pasó y/o mantenimiento de la fase lisogénica depende de que la cantidad de cI sea suficiente para reprimir los promotores PR y PR sin afectar la transcripción de él mismo a partir de PRM. El paso a lisis se debe a la presencia de cro que permitirá la expresión de los promotores anteriores, pero inhibirá la de PRM.


Regulón SOS

En una célula sana, lexA y recA se expresan muy poco, pero lo suficiente como para que LexAp mantenga reprimidos (inactivados) todos los genes que intervienen en la respuesta SOS. lexA y recA que son capaces de escapar tenuemente a esta represión. Cuando hay daño en el DNA, se generan fragmentos de ssDNA (huecos en dsDNA) que, al ser reconocidos por RecAp, se manifiesta su actividad proteolítica. De esta manera hidroliza a LexAp, con lo que su concentración baja, perdiéndose la represión de los genes SOS. Al desaparecer el ssDNA, se recuperan los niveles basales de LexAp y se reprime el regulón.



 
Recambio del mRNA

En procariotas, el mRNA sufre pocas o ninguna modificación tras su transcripción debido al acoplamiento con la traducción. Por tanto, lo único que puede considerarse en un  recambio  de la molécula. La mayoría de los mRNA tienen una vida media corta (2 a 3 minutos) debido a que estos organismos tienen que adaptarse rápidamente a los cambios ambientales. El mRNA empieza a ser digerido por la zona 5’ mediante una endorribonucleasa que genera distintos fragmentos de RNA. Estos nuevos fragmentos degradados son accesibles por la exorribonucleasa II (o polinucleótido fosforilasa, la enzima que S. Ochoa descubrió con una actividad inversa a la que realiza in vivo) que degrada el RNA en dirección 3’->5’. Esta exorribonucleasa se detiene ante estructuras secundarias, por lo que la presencia de cualquier horquilla detiene la degradación. Por eso es frecuente encontrar una secuencia repetida palindrómica (REP) que forma una horquilla en la zona 3' de los genes procariotas.

Procesamiento del rRNA

Los rRNA se transcriben como un RNA de mayor tamaño (pre-rRNA y pre-tRNA) que sufren una serie de procesamientos endonucleolíticos que generarán los RNA maduros. En el genoma de E. coli hay 7 operones distintos para codificar los rRNA, que se denominan rrnA-G. Cada uno contiene en un único transcrito las secuencias de los rRNA 16S, 5S y 23S separados a veces por uno o varios tRNA. La endorribonucleasa III se encarga de generar p16 y p23, los precursores del 16S y 23S respectivamente. En presencia de varias proteínas del ribosoma se termina su maduración. Los rRNA sufren metilación, formando N6,N6-dimetil-adenosina, y O2’-metil-ribosa. La metilación de la ribosa está relacionada con la protección de los enlaces fosfodíester para evitar la degradación de los rRNA. Una vez que el rRNA p23 está en el ribosoma se produce el corte que genera los rRNA maduros 5S y 23S.



 
Procesamiento de los tRNA

La mayoría de los tRNA de E. coli se transcriben en pre-tRNA que contienen de 1 a 7 tRNA cada uno, separados por secuencias flanqueantes largas. En el extremo 3’ del operón suele haber un gen traducible. El tRNA de la Tyr es uno de los mejor conocidos. Se sabe que en la etapa 4 (y antes de que se modifiquen las bases del tRNA) se puede reconstruir la secuencia CCA en los casos en los que la exorribonucleasa D haya degradado demasiado mediante la enzima tRNA-nucleotidil-transferasa. En algunos tRNA de algunas bacterias (incluida E. coli) ya se ha descrito el ayuste (splicing) necesario para eliminar intrones de la secuencia y producir el tRNA maduro final.

Técnicas experimentales

El  retraso en gel  es una técnica que permite saber si hay alguna proteína que reconozca una secuencia de DNA determinada. Si tal proteína existe, el complejo DNA-proteína migra más lentamente en un gel no desnaturalizante, mientras que si el DNA no es reconocido por ninguna proteína, migra más rápidamente con el frente electroforético. En la imagen ejemplo se muestra un DNA que es reconocido por dos proteínas distintas.


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