10.4 PRUEBA DE PCR EN EL
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
El
diagnóstico de muchas enfermedades hereditarias necesita una confirmación a
nivel molecular del defecto genético que presenta el paciente. Una vez
detectada la mutación y confirmado el diagnóstico clínico, podemos determinar cuál
es el efecto de dicha mutación en la proteína codificada (cambio de
conformación, alteración o pérdida de función, localización errónea,
disminución en su expresión, etc.), y así poder abrir puertas a nuevas terapias
dirigidas al defecto específico. En esta revisión, primero consideraremos algunos
conceptos básicos de genética molecular, incluyendo estructura y expresión del
gen, intrones y exones, códigos genéticos, transcripción, traducción,
procesamiento del RNA y mutaciones y sus tipos. También explicaremos algunos
métodos para extraer DNA y RNA de sangre u otros tejidos del paciente. A
continuación discutiremos los métodos que se emplean para detectar mutaciones en
genes asociados a enfermedades hereditarias. El principio en el que se basa un
ensayo de detección de mutaciones es que la secuencia de nucleótidos del gen de
un individuo afecto será distinta de la secuencia de un individuo con fenotipo
normal. Además, describiremos dos métodos para analizar el efecto de algunas
mutaciones en la maduración del pre-mRNA (RT-PCR a partir de RNA de sangre y
análisis de minigenes). Por último, mencionaremos algunos métodos informáticos
que sirven para determinar si las mutaciones detectadas son patológicas o no, y
para predecir el efecto de mutaciones en la maduración del pre-mRNA.
Los análisis genéticos se
diferencian de los análisis clínicos habituales en que sus resultados son
invariables en el tiempo, y por ello se realizan tan sólo una vez. Permiten
predecir el riesgo de padecer enfermedades genéticas y en ocasiones estos
resultados son de gran valor para establecer consejos genéticos a familiares y
parientes del afectado. Los diagnósticos
genéticos son de enorme potencial médico ya que se pueden realizar en el feto
en gestación o en embriones producidos tras la fecundación “in vitro”, previa a
la implantación en el útero materno. De esta manera se analiza la presencia de
alteraciones cromosómicas y genéticas en embriones de manera muy rápida. El
diagnóstico de patologías de origen genético, tiene un futuro muy prometedor y
sus posibilidades son enormes ya que se conocen más de 1.500 trastornos
originados por mutaciones en un único gen y la secuencia del genoma humano
desvelará los genes implicados en enfermedades multifactoriales, como el
cáncer.
Diagnóstico Molecular de Enfermedades
Genéticas
Diagnóstico Molecular de Enfermedades
Virales
Diagnóstico Molecular de Alteraciones
Cromosómicas
Los nuevos avances tecnológicos han favorecido el
desarrollo del diagnóstico sobre alteraciones genéticas prenatales, permitiendo
un diagnóstico certero sobre riesgos de anomalías cromosómicas en el feto.
A modo orientativo, alrededor de un 6% de los recién nacidos presenta algún tipo de anomalía congénita. Entre éstas, las alteraciones cromosómicas son las responsables de alrededor de un 2,5% de la mortalidad infantil. La amniocentesis, extracción de una muestra de líquido amniótico en la semana 14-16 de gestación, es la técnica más extendida y a medida que se va reduciendo el riesgo de aborto asociado a amniocentesis (menos del 1%), una creciente batería de pruebas genéticas se van incorporando como herramientas de gran valor diagnóstico precoz para un elevado porcentaje de anomalías cromosómicas.
Hasta fecha reciente estas pruebas eran ofrecidas por el ginecólogo en determinadas circunstancias: edad materna avanzada, anomalías ecográficas, antecedentes familiares, hijos anteriores con anomalías genéticas, abortos recurrentes, triple screening alterado o exposición a ciertos teratógenos. Sin embargo, y debido fundamentalmente a la reducción del riesgo de aborto asociado con la amniocentesis, cada día son más numerosos los especialistas que recomiendan incluir la realización de las pruebas de diagnóstico prenatal en el conjunto de pruebas que se realizan de rutina durante el desarrollo del embarazo, aunque no concurra ninguna de las circunstancias anteriores.
A modo orientativo, alrededor de un 6% de los recién nacidos presenta algún tipo de anomalía congénita. Entre éstas, las alteraciones cromosómicas son las responsables de alrededor de un 2,5% de la mortalidad infantil. La amniocentesis, extracción de una muestra de líquido amniótico en la semana 14-16 de gestación, es la técnica más extendida y a medida que se va reduciendo el riesgo de aborto asociado a amniocentesis (menos del 1%), una creciente batería de pruebas genéticas se van incorporando como herramientas de gran valor diagnóstico precoz para un elevado porcentaje de anomalías cromosómicas.
Hasta fecha reciente estas pruebas eran ofrecidas por el ginecólogo en determinadas circunstancias: edad materna avanzada, anomalías ecográficas, antecedentes familiares, hijos anteriores con anomalías genéticas, abortos recurrentes, triple screening alterado o exposición a ciertos teratógenos. Sin embargo, y debido fundamentalmente a la reducción del riesgo de aborto asociado con la amniocentesis, cada día son más numerosos los especialistas que recomiendan incluir la realización de las pruebas de diagnóstico prenatal en el conjunto de pruebas que se realizan de rutina durante el desarrollo del embarazo, aunque no concurra ninguna de las circunstancias anteriores.
Estas pruebas genéticas son de valioso complemento
a las ecografías del primer trimestre (12-14 semanas) segundo trimestre (19-21
semanas) y del tercer trimestre (32-34 semanas), así como a la ecocardiografía
fetal que permite el diagnóstico intraútero de las alteraciones del corazón y
de los grandes vasos.
En el laboratorio de genética, la batería de pruebas genéticas disponibles son:
En el laboratorio de genética, la batería de pruebas genéticas disponibles son:
1.- CARIOTIPO EN LÍQUIDO AMNIÓTICO
Permite descartar anomalías cromosómicas en células
fetales procedentes de líquido amniótico. El tiempo de respuesta para
resultados es de 18-20 días.
2.- PCR CUANTITATIVA FLUORESCENTE (QF-PCR)
En tan sólo
48 horas permite estudiar las aneuploidías más frecuentes (cromosomas 13, 18,
21, x e y). Nos permite discriminar entre embriones normales y embriones que
tienen alteración en el número cromosómico.
3.- CORDOCENTESIS
Cariotipo procedente de sangre fetal. Indicada
cuando no se obtengan resultados concluyentes por amniocentesis o cuando además
se quieran obtener otros datos importantes de la sangre fetal (anticuerpos...).
4.- CARIOTIPO EN RESTOS ABORTIVOS
Permite determinar la posible causa de aborto
mediante cariotipaje de restos abortivos.
5.- MLPA
Permite identificar alteraciones cromosómicas
asociadas al retraso mental y los síndromes polimalformativos más frecuentes.
En los últimos años se ha producido un considerable
aumento de la proporción de individuos de la población que tienen problemas de
infertilidad o esterilidad. Existen varios factores determinantes, como son la
edad, así como la frecuencia de anomalías cromosómicas halladas en la población
de infértiles, que se ha visto que está significativamente aumentada respecto
al resto de la población. Es indispensable conocer las causas para
posteriormente elegir la técnica reproductiva más adecuada.
- INFERTILIDAD MASCULINA
Los grandes avances en cirugía y las técnicas de
reproducción asistida permiten aplicar tratamientos exitosos en casos de
infertilidad masculina. Sin embargo por cada uno de estos éxitos se aumenta el
riesgo de aparición de anomalías genéticas en su descendencia. En nuestro
laboratorio aplicamos diferentes técnicas analíticas para el diagnóstico de
numerosas alteraciones genéticas relacionadas con la infertilidad masculina.
1.- CARIOTIPO EN SANGRE PERIFÉRICA
a) El
síndrome de Klinefelter (47, XXY) lo padecen aproximadamente la tercera
parte de los hombres con una producción espermática baja o ausente. Éste puede
presentarse en mosaicismo, siendo asintomático hasta que aparecen los problemas
de infertilidad.
b) Otro de
los síndromes que presentan azoospermia u oligospermia severa es el denominado XYY.
c) Se
calcula que en el 5% de las parejas con 2 ó más pérdidas fetales tempranas uno
de los miembros de la pareja tiene una translocación balanceada en
alguno de sus cromosomas. Las personas con este tipo de translocaciones son
asintomáticas, pero tienen un alto riesgo de transmitir una anomalía
cromosómica a su descendencia.
d) Disgenesia
gonadal: en el estudio del cariotipo encontramos dos líneas celulares 45, X/46,
XY; el 16% de los casos presentan un fenotipo masculino normal.
e) Varones
XX: estos
individuos si bien presentan cariotipo 46, XX tienen fenotipo masculino. El gen
SRY (implicado en la diferenciación testicular) está presente pero se han
perdido las regiones funcionales asociadas con el factor de azoospermia (AZF).
2.- MICRODELECCIONES DEL CROMOSOMA Y
La prevalencia calculada de estas microdeleciones
es de un 8,2% en hombres infértiles y aumenta hasta un 14,3% en
oligozoospérmicos. Se ha sugerido que los defectos en la producción espermática
asociados a microdeleciones pueden progresar a lo largo del tiempo, lo que
aconseja medidas preventivas como la crioconservación de gametos.
3.- FIBROSIS QUÍSTICA
Aproximadamente el 5% de los varones infértiles
poseen obstrucción epididimaria, idiopática o agenesia de los conductos
deferentes. De ellos el 75% tiene alguna de las mutaciones conocidas de la fibrosis
quística (FQ). La FQ es una enfermedad crónica y hereditaria que afecta
principalmente a los pulmones y sistema digestivo. Un diagnóstico precoz puede
mejorar la calidad de vida y prolongar la esperanza de estos pacientes. Es
indispensable el estudio de la pareja debido a la alta frecuencia de portadores
para esta enfermedad en la población general (1/20). El 80% de los casos de
fibrosis quística no presenta antecedentes familiares.
- INFERTILIDAD FEMENINA
En CircaGen aplicamos diferentes técnicas
analíticas para el diagnóstico de numerosas alteraciones genéticas relacionadas
con la infertilidad femenina.
1.- CARIOTIPO EN SANGRE PERIFÉRICA
- Existen síndromes cromosómicos que cursan sin síntomas aparentes cuando se encuentran en mosaicismo. Esta condición deriva en la falta de diagnóstico hasta que la mujer recurre a su ginecólogo por problemas de infertilidad. Ejemplos de estos casos son el síndrome de Turner (45, X0) o el síndrome de la triple X (47, XXX). Es importante detectarlos, ya que están asociados a un alto riesgo de tener hijos con anomalías cromosómicas.
- Se calcula que en el 5% de las parejas con 2 ó más pérdidas fetales tempranas uno de los miembros de la pareja tiene una translocación balanceada en alguno de sus cromosomas. Las personas con este tipo de translocaciones son asintomáticas, pero tienen un alto riesgo de transmitir una anomalía cromosómica a su descendencia.
2.- TROMBOFILIA HEREDITARIA
- Las trombofilias se relacionan con anomalías constitucionales y/o adquiridas de la coagulación sanguínea con riesgo de trombosis. La gestación provoca un estado de hipercoagulación fisiológica transitorio que agrava la situación. El estudio se basa en la detección de las mutaciones de algunos genes implicados en la cascada de coagulación sanguínea:
Factor II (protrombina)
Factor V de Leiden
(causante del fenómeno de la “resistencia a la proteína C activada”).
Metiléntetrahidrofolato reductasa (MTHFR) cuya
mutación produce hiperhomocisteinemia.
- La conjugación de ambos factores (embarazo y alguna de las mutaciones anteriormente citadas) aumenta considerablemente el riesgo de padecer preeclampsia, desprendimiento prematuro de placenta, muerte fetal y retraso en el crecimiento intrauterino. Estas alteraciones pueden presentarse sin haber tenido ningún tipo de síntoma anterior y afectan al segundo y tercer trimestre del embarazo.
- ESTUDIO DE DONANTES
En el Grupo CircaGen somos conscientes de la
demanda cada vez mayor de donaciones gaméticas, por lo que hemos diseñado un
conjunto de pruebas especiales para el estudio y genotipado de los donantes.
1.- Como primera opción ofrecemos el estudio
citogenético en sangre periférica. Es una prueba fiable y económica que
permite descartar la mayor parte de las anomalías cromosómicas presentes en la
población infértil. El hecho de ser un laboratorio especializado en
infertilidad nos permite reducir considerablemente el tiempo de entrega de
resultados presentándolos en una media de 8 días.
2.- Nuestra segunda opción es el tipaje genético
de los donantes. Ofrecemos la posibilidad de tipar donantes seleccionados para
la obtención de una remesa gamética libre de determinadas anomalías genéticas.
Como ejemplo podemos destacar el estudio de las mutaciones más frecuentes de la
fibrosis quística, la enfermedad genética más abundante en la raza blanca
(frecuencia de portadores de 1/20), lo que permite garantizar que el donante
seleccionado no es portador de ninguna de ellas.
1.- FIBROSIS
QUÍSTICA
Estudio mediante PCR e hibridación reversa de la
presencia en el gen CFTR de las 12 mutaciones más frecuentes de la Fibrosis
Quística conjuntamente con la variante alélica 5T responsable de la ausencia
congénita de los conductos deferentes.
2.- PROTROMBINA
(FACTOR II)
Estudio mediante PCR de la mutación G20210A del gen
de la Protrombina (Factor II) relacionada con la trombofilia hereditaria.
3.- FACTOR
V LEIDEN
Estudio mediante PCR de la mutación G16961A del gen
del Factor V (Factor V Leiden) causante de la resistencia a la proteína C
activada relacionada con la trombofilia hereditaria.
4.- METILÉNTETRAHIDROFOLATOREDUCTASA
(MTHFR)
Estudio mediante PCR de la mutación C677T del gen
de la Metiléntetrahidrofolato Reductasa (MTHFR) causante de
hiperhomocisteinemia asociada con la trombofilia hereditaria.
5.- PERFIL
TROMBOEMBÓLICO (FACTOR II, FACTOR V Y MTHFR)
Estudio conjunto mediante PCR de la mutación G20210A
del gen de la Protrombina (Factor II), de la mutación G16961A del gen del
Factor V (Factor V Leiden) y de la mutación C677T del gen de la
Metiléntetrahidrofolato Reductasa (MTHFR).
6.- HEMOCROMATOSIS
HEREDITARIA
Estudio mediante PCR de las mutaciones H63D y C282Y
del gen HFE relacionadas con la hemocromatosis hereditaria.
7.- SÍNDROME
DEL CROMOSOMA X-FRÁGIL
Estudio mediante PCR y electroforesis capilar en un
secuenciador de ADN de la zona repetitiva (CGG)n del gen FMR-1 responsable del
síndrome del cromosoma X-Frágil.
8.- ALZHEIMER
TARDÍO
Estudio mediante PCR de los polimorfismos del gen
ApoE relacionados con la predisposición al desarrollo de la variante tardía de
la enfermedad de Alzheimer.
9.- ALZHEIMER
TEMPRANO
Estudio mediante PCR de la mutación V717I del gen
APP y del polimorfismo intrónico S182 del gen PS1 relacionados con la
predisposición al desarrollo de la variante temprana de la enfermedad de
Alzheimer.
Genotipado PI.
10.- ENZIMA
CONVERTIDORA DE LA ANGIOTENSINA
Estudio de polimorfismo I/D ACE.
11.- INHIBIDOR
DEL ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO
Estudio de polimorfismos 675 4G/5G y A844G PAI-1.
12.- ENFERMEDAD
CELÍACA
Genotipado HLA-DQ / DR.
13.- ENFERMEDAD
PERIODONTAL (SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA)
Genotipado IL-1A, IL-1B y HLA-DR4.
14.- INTOLERANCIA
A LA LACTOSA
Estudio de T13910C y A22018G LTC.
15.- ALFA1-ANTITRIPSINA
Estudio mediante PCR de la mutación V717I del gen
APP y del polimorfismo intrónico S182 del gen PS1 relacionados con la
predisposición al desarrollo de la variante temprana de la enfermedad de
Alzheimer.
16.- HIPERCOLESTERINEMIA
FAMILIAR (APO B)
C9774T y G9775A ApoB.
17.- ATROFIA
MUSCULAR ESPINAL (SMA1 Y SMA2)
Delección exones 7 y 8 SMN1.
18.- CRANIOSINOSTOSIS
NO SINDRÓMICA
P250R FGFR3.
19.- DISPLASIA
TANATOFÓRICA (TIPOS 1 Y 2)
R248C y K650E FRFR3.
20.- DISTONÍA
DE TORSIÓN TEMPRANA (DYT1)
Del (GAG) TOR1A.
21.- HIPOACONDROPLASIA
N540K FGFR3.
22.- SÍNDROME
DE APERT
S252W FGFR2.
23.- SÍNDROME
DE CROUZON
C342Y y C342R FGFR2.
24.- SÍNDROME
DE PFEIFFER
S252F FGFR2.
25.- ATROFIA
ÓPTICA DE LEBER
G11778A mtDNA.
26.- CADASIL
R110C y C535T NOTCH3.
27.-
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Expansión HD.
28.- 46, XX TESTICULAR DSD (DISORDER OF SEX
DEVELOPMENT)
SRY.
29.- HEPATITIS VIRUS HBV
Detección.
30.-
HEPATITIS VIRUS HBV
Cuantificación carga viral.
31.- HEPATITIS
VIRUS HCV
Detección.
32.- HEPATITIS
VIRUS HCV
Cuantificación carga viral.
33.- MICROSPORIDIASIS
Detección.
34.- PATÓGENOS
EN PERIODONTITIS
Detección e identificación.
35.- TOXOPLASMA
GONDII
Detección.
36.- CANDIDA
Detección.
37.- ESTUDIO
MUTACIONAL DIRIGIDO
Cualquier locus.
38.- CÁNCER
HEREDITARIO DE MAMA Y OVARIO (BRCA1 Y BRCA2)
Screening de mutaciones más frecuentes.
Secuenciación BRCA1 y BRCA2.
Secuenciación BRCA1.
Secuenciación BRCA2.
Secuenciación BRCA1 y BRCA2.
Secuenciación BRCA1.
Secuenciación BRCA2.
39.- CÁNCER
HEREDITARIO COLORRECTAL NO POLIPÓSICO (HNPCC)
MPLA.
Secuenciación MLH1 y MSH2.
Secuenciación MLH1.
Secuenciación MLH1 y MSH2.
Secuenciación MLH1.
Secuenciación MSH2.
Secuenciación MSH6.
40.- POLIPOSIS
ADENOMATOSA FAMILIAR (APC)
Secuenciación APC.
41.- INESTABILIDAD
DE MICROSATÉLITES (IMS)
Mutaciones de genes de reparación de ADN.
1.-
DNA PAPILOMAVIRUS (DETECCIÓN Y TIPADO)
Estudio mediante PCR y
enzimas de restricción para la detección y tipado de 47 VPHs.
1.-
PRUEBAS DE PATERNIDAD A PARTIR DE LÍQUIDO AMNIÓTICO
Prenatalmente la prueba de
paternidad puede ser realizada a partir de una muestra de 3 ml de líquido
amniótico obtenida mediante amniocentesis de la futura madre. En este caso es
imprescindible obtener una muestra de la mucosa bucal o sangre de la madre
además de la del presunto padre biológico analizado. Si el centro ginecológico
lo considera, tanto la amniocentesis como la toma de muestras de los
solicitantes puede ser realizada en presencia de personal de nuestro
laboratorio que actuará como testigo, certificando la procedencia de todas las
muestras biológicas analizadas, quedando así el centro ginecológico exento de
toda responsabilidad jurídica. Posteriormente todas las muestras biológicas
serán custodiadas por nuestro personal hasta su recepción en nuestro laboratorio.
Esto es válido para Madrid y provincia. Para otras poblaciones consultar al
teléfono 91 426 11 44. La amniocentesis,
realizada de manera habitual por los ginecólogos para el seguimiento del
embarazo en el segundo trimestre del mismo, entre la semana 14 y la semana 20
de gestación, tiene pocas contraindicaciones, pero la mujer embarazada debe
saber que existe entre un 0.5 y 1% de riesgo de aborto. La amniocentesis se
realiza sin la hospitalización de la paciente, extrayéndose, mediante visualización
por ultrasonidos, entre 15 y 20 ml de líquido amniótico, suficiente para
realizar los análisis genéticos habituales.
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