sábado, 26 de mayo de 2012

10.7 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE


10.7 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Uno de los más grandes avances de la ciencia contemporánea ha sido el desarrollo de la ingeniería genética y la biotecnología. Por medio de estas dos disciplinas –muy relacionadas entre sí– se ha logrado manipular genéticamente a los individuos con el fin de propiciarles nuevas características.

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de restricción con la micromanipulación (conjunto de técnicas que permiten inyectar y succionar porciones de una célula) se desarrolló esta nueva tecnología, que ha abierto las puertas a un nuevo y amplio campo de acción a la genética molecular.

El principio de la tecnología de DNA recombínate se basa en la inserción de un fragmento de DNA foráneo en un hospedero de clonaje molecular  por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido. Una vez que el fragmento de DNA foráneo se ha introducido en el hospedero, comienza el proceso de clonaje molecular y la recombinación, dando como resultado la expresión del gen o los genes introducidos en un organismo diferente.

En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.

La ingeniería genética en plantas también ha provisto la mejora de ciertas especies haciéndolas más resistentes o introduciendo ciertas características de otros individuos para mejorarlas.

Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio. Las técnicas de bioremediación permiten una descontaminación de ambientes afectados por medio del uso de microorganismos capaces de degradar ciertas sustancias, en muchos casos se han empleado organismos nativos del lugar pero también se ha trabajado con numerosas cepas modificadas genéticamente para amplificar su acción sobre los contaminantes.

  • PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN


1.- PRODUCCIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA PARA RECOMBINACIÓN

Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodíester de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos. Se ha visto que ciertas cepas de E. coli degradan (cortan) el DNA de ciertos virus fagos infectivos, a menos que los ácidos nucleicos presenten metilación (adición de grupos metilo) en algunos residuos de adenina o citosina del sitio de corte.



Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffith et al. 1998).




 
Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

1.-  Corte con extremos cohesivos y
2.-  Corte con extremos romos (ver Fig.) (Griffith et al. 1998). 


 
Fig.  Producción de extremos (a) cohesivos y (b) romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.


Otro método para producir fragmentos pequeños de DNA para recombinación consiste en emplear ultrasonidos. Los ultrasonidos son capaces de romper al DNA cromosomal en pequeños fragmentos. A pesar de ser un procedimiento muy sencillo, tiene la desventaja de producir fragmentos aleatorios y no permite aislar genes con gran precisión (Mateos 2000), sin embargo son empleados por su facilidad de uso.

Algunas enzimas de restricción como EcoRV encuentran el sitio de restricción, por medio de un barrido a lo largo del surco mayor del DNA y reconocen una secuencia palindrómica de seis nucleótidos de longitud, en la que se presenta una simetría rotacional binaria. Cuando la enzima de restricción encuentra el sitio de corte, se producen una serie de reordenamientos estructurales en el DNA y se produce un ajuste inducido en el cual el DNA sufre una torsión de 50 grados. En este proceso se va haciendo un barrido muy rápido sobre la hebra de DNA, leyendo grupos de seis nucleótidos, hasta encontrar la secuencia diana. Esto comprueba el carácter altamente específico de las enzimas de restricción.

Los puntos de corte de las enzimas de restricción pueden ser empleados como marcadores para la elaboración de mapas de restricción. Para elaborar un mapa de restricción, se tiñen los fragmentos resultantes de la lisis y se los separa mediante una electroforesis PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) y se establecen las distancias de migración, siendo los resultados muy específicos para cada molécula de DNA en estudio.
Los extremos cohesivos son los más empleados en la construcción de DNA recombinante, puesto que al tener una porción lineal "pegajosa" es más sencillo que se produzca la unión con el DNA del hospedero, por complementación de bases, dicha unión se produce por la intervención de enzimas denominadas ligasas. Adicionalmente, la enzima transferasa terminal puede ser usada para generar extremos cohesivos en un fragmento de DNA. A pesar de ser más difícil, también es posible realizar uniones de extremos romos, mediante la adición de conectores sintéticos de DNA que actúan a manera de extremos cohesivos (como el caso de la transferasa terminal), sin embargo este procedimiento no es de mucha utilidad para realizar una clonación directa de DNA.

Existe otro tipo de enzimas de restricción de doble función, denominadas endo–exonucleasas, las cuales son capaces tanto de añadir nucleótidos como de removerlos de una hebra de DNA. Estas enzimas también son muy específicas y reconocen secuencias exactas, plantea que las enzimas de restricción del tipo endo–exonucleasas pueden tener un papel fundamental en la reparación del DNA y/o en la muerte de células defectuosas, gracias a la especificidad de la enzima. Se han hecho numerosos experimentos con endo–exonucleasas aisladas de E. coli, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, células de mono y células leucémicas de humano.



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