6.2.1 ETAPAS DE SÍNTESIS DEL ARN

6.2.1 ETAPAS DE SÍNTESIS DEL ARN

• Etapas de la transcripción

 Al igual que en procariotas, las etapas básicas son la iniciación, la Elongación y la terminación. Los procesos enzimológicos también son los mismos, por lo que vamos a ver cuáles son las diferencias esenciales que caracterizan al proceso eucariótico.

Hasta no hace mucho, los promotores se analizaban por deleciones seriadas desde el extremo 5' del gen, por lo que se consideraba que el promotor empezaba a partir del nucleótido más distal cuya deleción provocaba la pérdida de la capacidad transcriptora. Siguiendo este criterio, quedaban excluidos del promotor muchos elementos reguladores que no influían decisivamente sobre la transcripción del gen.

Para la transcripción se necesitan una serie de factores de transcripción que se nombran empezando por la abreviatura TF, le sigue el número de la polimerasa que reconoce, y termina por una letra que sirve para distinguirlos unos de otros. Por razones históricas, existen muchas excepciones a esta regla.

Iniciación

Durante la iniciación es cuando se produce el reconocimiento del promotor y asociación de la polimerasa. Es la parte más compleja de la transcripción y sobre la que se ejercerán la mayoría de las actividades reguladoras. Debido al gran tamaño del genoma, los factores de transcripción y la polimerasa tienen muy difícil reconocer sus sitios específicos. Para conseguir especificidad se requieren mecanismos másintrincados como el súper enrollamiento—condensar las regiones de DNA que no se tienen que expresar —con el objeto de disminuir la cantidad de DNA a rastrear. Como se verá, la presencia de los nucleosomas entorpece la transcripción de los genes.

La función del promotor esencialmente consiste en facilitar la unión de la RNA-polimerasa al DNA y asegurar que el inicio de la transcripción se realice con mucha eficacia y en un nucleótido determinado. El complejo de iniciación produce en la región de inicio de transcripción el desenrollamiento y separación de las dos cadenas del DNA (complejo abierto) que es donde va a tener lugar la síntesis de la cadena de RNA. Esta estructura se desplazará por el DNA a medida que avanza la elongación (burbuja detranscripción). Es necesario que se en torno a la RNA-polimerasa forme el complejo holoenzimático polimerasa para que se pueda empezar a transcribir. El modelo más aceptado propone que en la región promotora se van asociando los factores de transcripción y subunidades de la Holoenzima de manera ordenada y constante, hasta que se une la polimerasa central. También se requiere la presencia de una DNA-helicasa y la estabilización de la región desapareada con proteínas específicas. El proceso enzimático por el que se añaden los ribonucleótidos uno a uno a partir del primer nucleótido trifosfato es igual que el procariota.

1.- Decondensación del DNA para la transcripción

Para poder iniciar una transcripción, la maquinaria transcriptora ha de poder acceder a la hebra de DNA, lo que implica la descondensación previa de la región implicada del cromosoma. Este fenómeno se reconoció por primera vez al estudiar citoquímicamente los cromosomas politécnicos de las glándulas salivares de Drosophila.

 En los cromosomas politécnicos se distinguen una serie de bandas muy características y constantes. Cada banda contiene unos pocos genes (menos de 10) y desaparece cuando uno de estos genes se transcribe activamente, ya que se desempaqueta el DNA.

 

Para que la maquinaria transcripcional pueda acceder al promotor, éste ha de encontrarse descondensado (como máximo, debe estar en forma de fibra de 10 nm) y desprovisto de nucleosomas (se detectan como regiones hipersensibles a las nucleasas). En cambio, en esta región abundan las proteínas no histónicas como HMG14 y HMG17. La eliminación de los nucleosomas se debe al ensamblaje y desensamblaje de los mismos controlado por la acetilación de las histonas. La acetilación de los aminoácidos Lys y Arg (que aportan las cargas positivas) produce grupos amida que no se protonan a pH fisiológico, por lo que estas proteínas pierden su carga; tradicionalmente se pensaba que con ello se disminuye su afinidad por el DNA, pero parece más probable que la acetilación no influya en la interacción con el DNA sino entre las propias histonas del nucleosoma. Las actividades histona-acetil-transferasa e histona-desacetilasa se encargan de realizar este proceso. Cada vez es más evidente que los factores de transcripción tienen actividad acetil-transferasa para facilitar la liberación de los nucleosomas en torno a la secuencia que reconocen.

Durante la elongación de la transcripción, la RNA-polimerasa es capaz de desplazar los nucleosomas en la zona codificante: cuando la RNA-polimerasa se encuentra con uno, lo empuja sin esfuerzo los primeros 30 nt y luego se ralentiza hasta el nt 80 —con paradas cada 10 nt—, momento en el que el nucleosoma es desplazado por detrás de la enzima gracias a la energía potencial topológica que se acumula en las supe hélices por la tensión del DNA.

 

Inicio de la RNA-polimerasa I

Esta polimerasa, a diferencia de las otras dos, va a sintetizar un único tipo de transcrito, el pre-rRNA grande de 13,7 kb en los mamíferos (45S). El promotor de cada unidad detranscripción (que está repetida miles de veces en la mayoría de los genomas) abarca unas200 pb delante del inicio de transcripción y comprende dos regiones:

1.- El promotor basal, que va de la posición – 45 hasta la +20, por lo que incluye el inicio de transcripción (+1). Esta región es rica en G y C(salvo la parte del Inr alrededor de la posición +1, que es rica en A y T) y se necesita para iniciar correctamente la transcripción, siendo capaz de promover la transcripción por sí misma. No existe ninguna secuencia conservada entre especies — ya que sólo hay un promotor de estos porespecie — que pueda servir de señal de reconocimiento.

2.- La secuencia reguladora distal (UCE: upstream control element  o URS, upstreamregulatory sequence) se sitúa en la parte 5’ del gen, entre las posiciones – 107 y – 180. Sueliminación hace que la transcripción descienda hasta 100 veces. Su secuencia es un 85%homóloga a la del promotor basal y también rica en GC.

 

La falta de homologías en las secuencias promotoras de este tipo de genes hace que sean promotor es muy específicos de especie y no sean reconocidos por la maquinaria de transcripción de especies heterólogas.

Los factores que reconocen este promotor para facilitar la entrada de la RNA-polimerasa I son:

1.- UBF ( upstream binding factor  ): es un homodímero que reconoce la UCE y provoca un giro de 360° que acerca esta región al promotor basal, con lo que mejora la eficacia de la transcripción al interaccionar con el otro factor de transcripción (SL1). Otros autores proponen que UBF reconoce a la vez el promotor basal y el UCE, y por eso induce el giro en el DNA.

2.- SL1 (selective factor, también denominado TIF-IB o Rib1 en otras especies): es unheterotetrámero formado por la TBP (TATA binding protein) y tres TAF I (TBP associatedfactors). La unión del SL1 reconoce el promotor como funcional y permite que se una la RNA-polimerasa I para comenzar la transcripción; por eso, la función del SL1 recuerda la del factor σ de la RNA polimerasa bacteriana.

La TBP se aisló inicialmente de los promotores de la RNA-polimerasa II como la proteína que reconocía específicamente la caja TATA en estos promotores.

Los TAF I sí suelen ser específicos de los promotores. El subíndice indica el tipo de promotor al que se unen. Las distintas moléculas de TAF del mismo factor de transcripción suelen ser distintas. Algunos TAF se ha visto que también forman parte de otros complejos proteicos que están directa o indirectamente relacionados con la regulación de la transcripción—como lashistona-acetil-transferasas— . Los TAF se asocian entre sí mediante el dominio HFD (  histone fold domain  ) de la misma forma que se asocian las histonas.

Por tanto, se deduce que el SL1 se une al promotor de forma similar a como lo hacen el DNA y los nucleosomas.

Inicio de la RNA-polimerasa III

Ninguno de los genes que transcribe esta polimerasa produce una proteína, sino RNA funcionales, y son pequeños (menores de 300 nt): pre-rRNA 5S; los tRNA; algunos RNA pequeños que intervienen en el ayuste—snRNA U6, 7SK, 7SL, 4,5S y M—y los microRNA. Todos comienzan con una G y se localizan sobre la zona codificante (no delante como todos los demás) en lo que se denomina la región interna de control ( ICR : interna al control región  ). Cadena arriba hay una secuencia necesaria para la especificidad y eficacia del sitio de inicio: la secuencia reguladora proximal (URS : upstream regulatory sequence ).

Inicio de la RNA-polimerasa III

Ninguno de los genes que transcribe esta polimerasa produce una proteína, sino RNA funcionales, y son pequeños (menores de 300 nt): pre-rRNA 5S; los tRNA; algunos RNA pequeños que intervienen en el ayuste—snRNA U6, 7SK, 7SL, 4,5S y M—y los micro RNA. Todos comienzan con una G y se localizan sobre la zona codificante (no delante como todos los demás) en lo que se denomina la región interna de control ( ICR : internal control región  ). Cadena arriba hay una secuencia necesaria para la especificidad y eficacia del sitio de inicio: la secuencia reguladora proximal ( URS : upstream regulatory sequence ).

Según se coloquen la ICR y la URS, se distinguen tres tipos de promotores:

De tipo «a» (como el de la figura) El del rRNA 5S. La ICR incluye dos cajas ( A y C ), de unos 20 pb cada una, entre las regiones +55 y +80, que son reconocidas inicialmente por el factor TFIIIA. La presencia del TFIIIA provoca una curvatura en el DNA y a continuación atrae al factor TFIIIC. Con el consumo de ATP, se une el factor TFIIIB que también necesita la existencia de la caja A, pero no de la C. Con la entrada del TFIIIB en presencia de TFIIIA y TFIIIC se ha formado el complejo de preiniciación con lo que puede incorporarse la polimerasa. El complejo de preiniciación indica que el gen está listo para ser transcrito, es un complejo estable y puede mantenerse a lo largo de varios ciclos de replicación; in vitro, el promotor funciona con tal de que el TFIIIB ya estuviera unido.

De tipo «b» El de los tRNA, snRNA y posiblemente los microRNA. No tienen caja C, pero tienen una caja B en posiciones variables y una caja A más cercana al inicio de transcripción, y no necesitan el TFIIIA. La interacción del TFIIIB sólo depende de la presencia de la caja A.

De tipo «c» El del gen del snRNA U6 y 7SK. No son intragénicos—no presentan IRC— sino que se encuentran en la región 5' del gen, contienen una caja TATA a – 25, que es lo que reconoce el TFIIIB, y la URS está en –60. Necesitan que el factor detranscripción SNAPc se una al TFIIIB para que luego se una la polimerasa. Durante muchos años se dudó de que fuera la pol-III y no la pol-II la que los transcribía.

El TFIIIA es una proteína de 37 kDa con 9 dedos de zinc como dominio de unión al DNA en su región N- terminal, que ocupa casi toda la proteína.

El TFIIIC es un complejo proteínico de más de 500 k Da con al menos 5 subunidades diferentes.

El TFIIIB es equivalente al SL1, pues se trata de un heterotetrámero formado por la TBP y tres TAF III diferentes entre sí y a los vistos para el SL1. TFIIIB sitúa la RNA-polimerasa III correctamente en el inicio de transcripción sobre la URS.

 

Los promotores de la RNA-polimerasa II

Los genes transcritos por la RNA-polimerasa II son todos los mRNA y muchos snRNA implicados en su ayuste, por lo que son los responsables de las proteínas de la célula. Los promotores se localizan siempre en la zona 5' no codificante previa al sitio del inicio de la transcripción.

Aunque la estructura de estos promotores es bastante dispar, se pueden definir los tres elementos esenciales de este tipo de promotores:

1.- Promotor basal o mínimo: es el que determina el sitio de inicio de transcripción. En esta parte se encuentran varios elementos comunes a todos los promotores. Éstos son la Caja TATA para verificar que es un promotor, la secuencia iniciadora Inr para determinar el inicio de transcripción, y el amentó de respuesta al TFIIB (BRE ) para orientar el promotor.

2.- Los elementos proximales: se encarga de determinar la frecuencia con la que se debe iniciar la transcripción. Los elementos proximales más importantes son la caja CAAT, las cajas GC y las secuencias distales específicas ( SDE ).

3.- Los elementos distales: se encuentran a más de 1 kpb del inicio de transcripción, tanto hacia 5' como hacia 3', y funcionan independientemente de su orientación. Los hay potenciadores y silenciadores.

 

Muchos autores prefieren definir los promotores sólo como los elementos basales y proximales, dejando a los terceros exclusivamente como secuencias reguladoras.

Inicio de los promotores de la RNA-pol II

La RNA-polimerasa II interacciona simultáneamente con gran variedad de factores de transcripción. Según se unan a cada uno de los elementos descritos anteriormente, se puede hablar de factores detranscripción generales (reconocen los elementos basales), Proximales (reconocen los elementos proximales) e inducibles (reconocen los elementos distales y los SDE). La forma y el orden en que se unen determina el inicio de la transcripción.

Factores de transcripción generales y cómo se unen

Los factores generales, al reconocer las secuencias más conservadas, son a su vez, los más conservados. Promueven la formación del complejo de inicio, mediando la fijación de la polimerasa y el correcto punto de comienzo de transcripción. Véase un esquema general del proceso.

 

La secuencia de unión de estos factores comienza con la unión del TFIID al surco menor del DNA (libre de histonas) a través de la caja TATA (o del MTE/DPA) a través de la TBP, protegiendo unos 35 pb. Esta  etapa es la crítica en el proceso. El TFIID está muy conservado y parece ser el único que reconoce específicamente una secuencia de DNA, la caja TATA, aunque también se une a promotores que no la tienen, uniéndose, en tal caso, al elemento Inr. Su tamaño es de unos 800 kDa. Uno de sus componentes es la TBP que aquí sí reconoce específicamente la caja TATA. La TBP tiene un dominio de unión a DNA un poco especial que se conoce como «silla de montar». In vitro basta la TBP para iniciar una transcripción. Los otros componentes del TFIID son varias moléculas de TAF II (de 9 a 12 distintas) que varían enormemente de unos promotores a otros. Una buena parte de las TAF son proteínas reguladoras y factores específicos de tejido u órgano y otras median entre el complejo basal de la RNA-polimerasa y algunos reguladores. Por tanto, las TAF II son necesarias para responder a la regulación de los promotores.

Factores de transcripción proximales

Son los que contribuyen a aumentar la eficacia de la formación del complejo de inicio, o bien favorecen la actividad de la propia polimerasa. Cada promotor necesita un conjunto preciso de estos factores para su funcionamiento óptimo. A modo de ejemplos:

1.- CTF (también conocido como NF1 ): interacciona con la caja CAAT y hace aumentar la eficacia del promotor. El dominio que hace de activador es del tipo rico en Pro (20%) de la secuencia.

2.- CBP, ACF, CP1 y CP2 también interaccionan con la caja CAAT en distintos tipos celulares, por lo que se sugiere que debe existir una familia de de proteínas capaces de discriminar las distintas cajas CAAT.

3.- SP1 (monómero de 105 kDa): se une a las cajas GC, pero no a todas, por lo que las secuencias adyacentes han de influir de alguna manera en esta interacción, ya que su unión protege unos 20 nt, cuando el motivo GC es sólo de 6-8 nt. Contacta con TFIID, activando la transcripción. El motivo de unión a DNA de SP1 son 3 dedos de Zn en la zona C-terminal. El dominio activador tiene un 25% de Gln.

Factores de transcripción inducibles o distales

Los factores que reconocen los elementos distales facilitan (o impiden) la formación del complejo de inicio de transcripción. A diferencia de los anteriores, sólo están presentes en momentos específicos o en células que lo requieren. O sea, son reguladores y se verán ejemplos característicos en el tema de la regulación eucariótica.

Lo habitual es que el contacto no sea directo entre el factor distal y la polimerasa, sino que esté mediado por un coactivador que interacciona simultáneamente con la polimerasa y con el factor distal. Uncoactivador se define como «aquellos factores que se necesitan para ejercer el efecto de los activadores que se unen al DNA, pero que no son necesarios para la transcripción basal per se, ni muestran una unión específica de sitio por sí mismos».

Los coactivadores suelen estar formados por muchas subunidades proteicas. Puesto que el mismo coactivador puede recibir señales de distintos potenciadores, son distintas subunidades de éste las que van a interaccionar con los elementos distales. Uno de los coactivadores holoproteicos más conocidos en humanos recibe el nombre de Mediador. Se trata de un complejo de más de 20 subunidades (más grande que la propia RNA-polimerasa) tan conservado que es capaz de reconocer señales que provienen de activadores de distintas especies. Se ha visto que se organiza en módulos que se pueden disociar del conjunto (coincidiendo con los colores de los dibujos anteriores y con la recogida y envío de las señales).

En la figura de la derecha se esquematiza la estructura del complejo mediador y a la derecha cómo interacciona con la RNA-polimerasa y con el DNA.

Elongación

La Holoenzima ha permanecido inmóvil mientras se polimerizan los primeros nucleótidos, hasta que el TFIIK fosforila el CTD, activado por el TFIIE. Se ha visto que este dominio fosforilado se ubica muy próximo al canal por el que sale el RNA que se está sintetizando, por lo que se piensa que interviene en la transferencia de factores proteicos al mRNA naciente. Tras la fosforilación, la polimerasa se libera de todos los factores de iniciación excepto la helicasa del TFIIF y comienza su avance por el DNA. En torno al elemento Inr pueden quedarse los TFII A, B y D así como otros activadores de la transcripción, listos para reiniciar otro ciclo de transcripción—esta vez más abreviado puesto que las primeras estapas no han de repetirse—.

 

Una actividad helicasa sigue abriendo el DNA por delante, lo que genera importantes tensiones en la molécula que se compensan por la acción de las topoisomerasas. Por detrás de la polimerasa el RNA recién sintetizado se va desapareando del DNA molde y quedando en forma de cadena sencilla de RNA. Las dos cadenas de DNA se vuelven a aparear y gracias a la asistencia de otra topoisomerasas, serebobina de nuevo el DNA. En esta etapa intervienen al menos 16 factores de elongación cuyo mecanismo exacto se desconoce. Su función siempre aparece relacionada con 3 fenómenos principales:

1.- La eliminación de las pausas o paradas de la polimerasa. Los mejor identificados son TFIIS (antes llamado SII) que sirve para evitar que la RNA-polimerasa se detenga prematuramente (limita las pausa de la RNA polimerasa. La presencia de este factor también se necesita para que se estimule la actividad editora.) y por los factores que alteran la Km y la Vmax de la enzima para incrementar su capacidad catalítica: ELL, CSB y SIII (elonguina).

2.- Para que la polimerasa funcione, tiene que estar fosforilado hSPT5. Gracias a este factor se recluten las enzimas necesarias para la adición de la caperuza: también sirve para que se incorpore TAT-SF1 que es necesario para que se reclute en los sitios adecuados la maquinaria del ayuste. También se incorporan las proteínas que intervienen en la remodelación de los nucleosomas durante la elongación (SWI/SNF, FACT, HMG14, elongator...), ya que sigue siendo necesario despejar el camino.

3.- El mantenimiento del estado fosforilado del CTD ( PTEFb y otros), ya que sudesfosforilación inhibe la elongación. Este factor también mantiene fosforilado el hSPT5.También sirve para reclutar otros factores como AT-SF1.

Está claro que la elongación, la terminación y la maduración del mRNA están íntimamente interconectados y necesitan estar coordinados con precisión.

 

Terminación

Las secuencias terminadoras propiamente dichas están aún poco caracterizadas, pero se ha visto que provocan dos efectos:

1.- detención o pausa en el avance de la polimerasa al pasar por ellas.

2.- desestabilización del híbrido RNA—DNA.

El resultado final es la separación de los componentes del complejo de transcripción (incluida ladesfosforilación del CTD de la RNA-polimerasa II) y desensamblaje de la Holoenzima para ser reciclada en otro complejo de iniciación. El extremo 3’ de los RNA eucarióticos transcritos no coincide con el extremo 3’ de los RNA maduros ya que es habitual que los extremos de los transcritos primarios se corten durante la maduración (excepto los de la RNA-polimerasa III). También se comprende la dificultad del estudio de las secuencias y mecanismos de terminación, ya que los transcritos primarios (hnRNA y otros pre-RNA) son de corta vida y difícil purificación.

Terminación de la RNA-polimerasa I

Los rRNA se expresan mucho debido al confinamiento de estos genes en el nucléolo, la ausencia de nucleosomas en su región codificante y el estar repetidos en tándem. Por otra parte, el acoplamiento entre el fin de la transcripción de un pre-rRNA con el comienzo del siguiente (posición en tándem) acelera aún más esta transcripción: cuando la terminación de la transcripción de un gen acaba cerca del promotor del siguiente, se activa la transcripción del segundo gen ya que resulta más rentable polimerizar secuencia inútil que soltar el DNA y volver a iniciar otra transcripción. La señal de terminación de los rRNA es una secuencia de 18 pb duplicada que se encuentra triplicada, de la que hay dos copias cerca del extremo 3’ del gen 28S (T1 y T2) y la tercera a 200 pb del inicio de transcripción del gen siguiente (T3).

 

En una secuencia indeterminada se une una proteína terminadora ( Reb1p en las levaduras o TTF-I en los mamíferos) que detiene el avance de la RNA-polimerasa. Una vez detenida, una región rica en T en la cadena codificante facilita la separación del RNA. No se ha observado que se formen horquillas.

 

Terminación de la RNA-polimerasa II

Esta enzima tiene un mecanismo equivalente al de la terminación dependiente de ρ de procariotas. Se ha observado que la enzima se detiene en la región de terminación debido bien a secuencias específicas en el DNA, o bien a proteínas que favorecen la pausa que aún no se han identificado. Una proteína similar a ρ se une al RNA e induce la separación del complejo holoenzimático. De hecho se ha comprobado que la propia ρ de E. coli  es capaz de inducir esta terminación. Está directamente relacionada con la poliadenilación del mRNA.

Terminación de la RNA-polimerasa III

Esta enzima tiene un mecanismo equivalente al de la terminación intrínseca en procariotas. La detención de la RNA-polimerasa se produce en alguna de las T que hay al final del gen. Se producen diferencias en la terminación dependiendo del tipo de promotor que se ha utilizado en la iniciación:

1.- Si es un promotor de tipo «a», el TFIIIA atrae los factores de terminación específicos que van a reconocer las T si van precedidas de un palíndromo de GC.

2.- Si es un promotor de tipo «b» es TFIIIC el que atrae los factores de terminación.

 3.- Si es un promotor de tipo «c», SNAPc es la que va a reclutar los factores de terminación que van a reconocer las T dentro de una zona rica en A puesto que se ha visto que la presencia de G inhibe la terminación en este caso. A diferencia de la terminación de las otras dos polimerasas, estos transcritos no van a sufrir ninguna modificación en su extremo 3’, por lo que todos acaban en varias UUU.