10.1 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

10.1 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

• EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común que va a permitir el desarrollo de un método de separación específico para ellas. Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La modificación de las diferentes fases estacionarias ya existentes, así como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas.

• CROMATOGRAFÍA DE PENETRABILIDAD

El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.

Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de sílica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño.

• CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero efluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero efluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, efluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Una modificación de este método es la extracción en fase sólida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unión se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elución se va incrementando la concentración de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (DNA y/o RNA).

 

 

• CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana.

Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc.

 

 

 

1.- ULTRAFILTRACIÓN

En esta tecnología, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los ácidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Después de un paso de lavado opcional, se recuperan los ácidos nucleicos añadiendo agua o un tampón adecuado.

 

2.- BOLAS MAGNÉTICAS

Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los ácidos nucleicos purificados se eluyen de la solución con las bolas paramagnéticas bajo condiciones de baja salinidad y están listos para ser usados en posteriores aplicaciones.

 

PASOS GENERALES DE LA EXTRACCIÓN

Todos los métodos de preparación de las muestras pueden dividirse en una serie de pasos generales, de tal forma que la necesidad de cada paso dependen del microorganismo y de la muestra:

1.- Liberación de los ácidos nucleicos de las bacterias, hongos o virus. Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias (Mycoplasma spp.) pero muy difícil en el caso de otras bacterias (Mycobacterium tuberculosis) y hongos.

Hay una gran variedad de métodos para la liberación de los ácidos nucleicos de diferentes microorganismos, entre los que se encuentran el hervir en agua destilada o tampón de PCR, el uso de detergentes con o sin calor, hidróxido sódico con calor, ciclos de congelación-descongelación, SDS-proteinasa K, ácido perclórico, enzimas (lisozima), sonicación, etc. aunque la utilización de enzimas no es muy recomendable ya que la propia muestra puede contener inhibidores de las mismas.

2.- Protección y estabilización de los ácidos nucleicos frente a la degradación. El RNA es mucho más difícil de estabilizar que el DNA.

Eliminación de inhibidores de la amplificación. Para algunas muestras (esputo, sangre) pueden ser necesarios más pasos que para otras (orina, LCR).

3.- Concentración de la muestra y la diana en un pequeño volumen. Algunas muestras (esputo para M.tuberculosis y Legionella pneumophila y sangre para sepsis) requieren una mayor grado de concentración que otras (orina para Chlamydia o Gonococcus) para alcanzar la sensibilidad deseada.

4.- Colocación de la diana en un medio acuoso compatible con el método de amplificación

Los laboratorios generalmente utilizan diferentes métodos para aislar el DNA de diferentes bacterias (ya sean gramnegativas o grampositivas); esto es un problema ya que requiere la preparación y almacenamiento de una gran cantidad de reactivos y tampones y la utilización de diferentes protocolos de extracción. A continuación se muestra un protocolo universal de extracción de DNA genómico con el que se pueden extraer entre 100 y 400μg de DNA; consta de un módulo central (útil para la extracción de DNA de bacterias gramnegativas, incluyendo las encapsuladas y las productoras de polisacáridos) y un módulo opcional (permite la extracción de bacterias grampositivas):

3.- MÓDULO CENTRAL

1.- Cultivar los microorganismos en el medio más adecuado o en 5-10mL de medio de cultivo. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estéril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensión (3,3mL de NaCl 3M; 1,0mL de Tris 1M pH 8,0; 2,0mL de EDTA 0,5M pH 8,0; 58,5mL de sacarosa y ajustar el volumen a 100mL). Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600×g a 4°C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensión.

2.- Centrifugar la suspensión durante 5min a 3600×g a 4°C. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 3,78mL de buffer de suspensión.

3.- Añadir 200μL de SDS al 20% y mezclar completamente mediante inversión. Incubar la mezcla a 37°C durante 30min. Añadir 20μL de proteinasa K (20mg/mL), mezclar y continuar incubando a 37°C durante otro 30min.

4.- Añadir 720μL de NaCl (5M), mezclar completamente, añadir 600μL de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) y mezclar por inversión. Incubar a 65°C durante 10min y a 37°C durante 5min.

5.- Añadir un volumen igual de PCI (25:24:1 fenol-cloroformo-alcohol isoamílico). Centrifugar a 1500×g durante 15min. Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir un volumen igual de CI (24:1 cloroformo-alcohol isoamílico) y centrifugar durante 15min a 1500×g.

6.- Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir 2,5 volúmenes de etanol frío al 95%, mezclar por inversión y mantener a -70°C durante 30min.

7.- Centrifugar durante 30min a 14500×g. Eliminar el sobrenadante y secar el pellet mediante vacío. Resuspender el pellet en 400μL de buffer TE (Tris HCl 10mM; EDTA 1mM pH 8,0)

8.- Añadir 1μL de una dilución 1:3 en agua estéril de RNasa T₁. Incubar la mezcla a 37°C durante 1h.

9.- Centrifugar a 19900×g durante 2min.

10.- Traspasar la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Añadir 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M y mezclar bien. Precipitar el DNA con 2,5 volúmenes de etanol frío al 95%. Mantener a -70°C durante 20-30min.

11.- Centrifugar durante 8min a 19900×g. Eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500μL de etanol al 70% y volver a centrifugar durante 8min.

12.- Descartar el sobrenadante, secar el DNA a vacío (15-30min) y disolver el pellet de DNA en 100-400μL de agua estéril.

13.- Medir la concentración de DNA en un espectrofotómetro: diluir un alícuota 1:20 (15μL en 285μL de H₂O), y leer a λ = 260nm. La A₂₆₀ es igual a la concentración de DNA en gr/L.

 

Esquema del módulo central del protocolo universal de extracción de DNA genómico.

4.- MÓDULO OPCIONAL PARA BACTERIAS GRAMPOSITIVAS 

1.- Cultivar las bacterias en el medio más adecuado o en 5-10mL de medio de crecimiento. Si se utilizan placas de agar, recoger las colonias con un asa estéril y suspenderlas en 5mL de buffer de suspensión. Centrifugar las colonias durante 5min a 3600×g a 4°C. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1mL de solución de prelisis (0,25mL de Tris 2M pH 7,0; 3,1mL de lipasa pancreática; 0,3mL de taurocolato sódico; 0,5mL de CaCl₂ 0,1M; 5,85mL de sacarosa y 0,05gr de lisozima) e incubar a 37°C durante 45min.

2.- Si se utiliza medio de crecimiento, centrifugar las colonias durante 5min a 3600×g a 4°C, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5mL de buffer de suspensión. Centrifugar durante 5min a 3600×g a 4°C y eliminar el sobrenadante. Resuspender en 1mL de solución de prelisis e incubar a 37°C durante 45min.