10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

• LA HIBRIDACION

 Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.

 

• QUÉ ES UNA SONDA

Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula repórter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación.

Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos: 

1.- Fragmentos de DNA.

2.- Fragmentos de RNA.

3.- Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.

• QUÉ SON LAS MOLÉCULAS REPÓRTER

Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas repórter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa...) y quimioluminiscentes (esteres de acridina).

 

• QUÉ FACTORES AFECTAN A LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN DE HIBRIDACIÓN

1.- Concentración del ácido nucleico diana.

2.- Complementariedad sonda-ácido nucleico diana.

3.- Concentración de la sonda.

4.- Longitud de la sonda.

5.- Actividad específica de la molécula repórter.

6.- Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación,...)

7.- Tm.

8.- Acceso al ácido nucleico diana.

9.- Formato de hibridación.

• CUÁLES SON LOS FORMATOS DE HIBRIDACIÓN

1.- HIBRIDACIÓN EN SOLUCIÓN

La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de formación del dúplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protection assay.

2.- HIBRIDACIÓN EN FASE SÓLIDA

El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminadas mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución.

Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación.  

Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en Biología Molecular: los Southern blot (DNA cortado con enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y Northern Blot (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis, trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección.

 

3.- HIBRIDACIÓN IN SITU

Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. El empleo de proteasas,  que facilitan el acceso de la sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el empleo de oligosondas.

  

4.- SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID)

Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Su estructura está formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick.  Las bases (A,T, C,G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA.

Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales:

1.- Son moléculas de simple cadena.

2.- No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible.

3.- Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles.

4.- Presentan una especificidad y sensibilidad más elevada que los oligomeros DNA/RNA.

5.- Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede.

6.- Enlaces más fuertes.

7.- Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.

• SECUENCIACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen dos métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico.

En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restricción. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.

 

      ESPECIFICIDAD 

BASE                REACTIVO        

G                Dimetil sulfoxido

G+A                Acido fórmico

T                Permanganato Potásico

C                Hidroxilamina

 

• POSTERIORMENTE SE ANALIZAN LOS FRAGMENTOS EN GELES DESNATURALIZANTES

El método enzimático es el más utilizado en la actualidad. Se prepara un DNA circular lineal (clonando en el fago M13). Se introduce un cebador que va a servir para el inicio de la síntesis del DNA que vamos a marcar y a secuenciar. El cebador es específico a una secuencia complementaria del fago M13. Una polimerasa (enzima de Klenow o secuenasa) se encarga de polimerizar. Se establecen cuatro alícuotas. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos utilizando para ello los cuatro nucleótidos, pero uno de ellos está marcado. En el segundo paso se produce la terminación de las cadenas por la adición de una pequeña cantidad de un dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideoxido es un nucleótido trifosfato que por carecer de grupos OH tanto en el carbono 2´como el 3´de la ribosa lo que imposibilita el crecimiento de la cadena y paraliza la síntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizan por electroforesis en geles de acrilamida.

Actualmente para el marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceína, NBD (4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno para cada base. . Una vez conjugados a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e interrupción con dideoxis.

Geles de secuenciación

 

• TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

Se reúnen con esta denominación una serie de técnicas que nos van a permitir un aumento considerable en la detección de secuencias específicas de los ácidos nucleicos

     

AMPLIFICACIÓN DE LA DIANA

1.- PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

2. - 3SR (Self sustaining sequence replication).

3. - NASBA (Nucleic acid sequence based amplification).

4. - SDA (Strand displacement amplification).

5. - Qbeta replicasa.

6.- LCR (Ligase chain reaction).

AMPLIFICACIÓN DE LA SEÑAL

7. - Branched probe.

8. - Gen point (hibridación in situ).

EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO

1. Muestra = Extracción de A.N.
2. Amplificación de zona interés.
3. Secuenciación.