6.2.2 MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES DEL RNA MENSAJERO

6.2.2 MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES DEL RNA MENSAJERO

Los procesos de maduración son los que llevan a los transcritos primarios a convertirse en transcritos maduras. Mostrados sobre un mRNA, son:

Todos estos procesos ocurren mientras el RNA se está transcribiendo, demostrándose en algunos casos la interdependencia entre transcripción y maduración.

• Intrones y exones

En 1977 Philip Sharp y Richard Roberts probaron por separado que los genes que codifican polipéptidos en los eucariotas se encuentran interrumpidos por secuencias no codificantes (intrones o secuencias intercaladas). Se probó hibridando DNA genómico con los mRNA que transcriben. Al microscopio electrónico se observaba la presencia de lazos y trazos gruesos. Los lazos son los intrones, y la parte más gruesa el híbrido DNA-RNA. La eliminación de los intrones se denomina ayuste (splicing) o «corte y empalme» porque se eliminan secuencias internas del propio transcrito y se reúnen los exones.

Por tanto, las secuencias que permanecen en el transcrito maduro, y que flanquean a los intrones, se llaman exones. En general, son la parte codificante del gen, pero el primer y el último exón también incluye las regiones 5’ y 3’ no codificantes. No hay que confundir la eliminación de intrones con la eliminación de secuencias en los extremos 5’ o 3’ por la acción de las nucleasas.

La transcripción de los intrones consume muchos recursos de la célula, por lo que los intrones se consideran parásitos moleculares. Pero las células han sabido sacar provecho de ellos para aumentar la diversidad genética, e incluso economizar genes —por ayuste alternativo (véase más adelante) se pueden conseguir diferentes proteínas con un solo gen—. También es frecuente que los dominios estructurales de las proteínas se corresponden con exones, por lo que la aparición de nuevas actividades enzimáticas eucarióticas podría deberse al barajado de intrones durante la recombinación.

Son pocos los genes eucariotas que no cuentan con intrones en su gen. Como excepción están, por ejemplo, las histonas. También se han detectado intrones en algunas bacterias, fagos (T4) y arqueas. Lo más frecuente es que la longitud total de los intrones supere ampliamente la suma de los exones, por lo que un gen depende enormemente del número y longitud de sus intrones. Se pueden encontrar hasta 40 intrones por gen, e intrones de hasta 20 kpb. Los exones rara vez miden más de 1 kpb. Las levaduras, en cambio, tienen uno o ningún intrón, y muy pocos genes tienen dos intrones. Cuanto mayor es el genoma, mayores son los tamaños de los intrones. Por la forma de eliminar el intrón se han establecido IV grupos distintos.

 

Aunque la mitocondria de las levaduras sin intrones parece igualmente viable, se ha visto que el bloqueo del ayuste en Euglena hace que la adición del CCA a los tRNA sea menos eficaz. También se ha visto que el aumento de la inestabilidad genómica y la aceleración de la senescencia de las mitocondrias de Podospora aumentan por la presencia de intrones del grupo II.

• Intrones del grupo I

Además de en los eucariotas, se pueden encontrar en las arqueas y los procariotas. Más concretamente, se encuentran en:

• rRNA, tRNA y mRNA de los orgánulos de los hongos, las plantas y los protistas, y los rRNA nucleolares de estos organismos;
• tRNA y mRNA de las bacterias y los bacteriófagos;
• mRNA de las mitocondrias de las anémonas

Sus principales características son:

1. Se auto-procesan in vitro aunque algunos necesitan la intervención de la proteína que está codificada por el ORF del intrón: las madurasas. Algunas de ellas también tienen actividad retrotranscriptasa o endonucleasa que sirven para él la transposición y el homing del intrón.
2. Requieren un cofactor externo que es un nucleósido o nucleótido de guanina (guanosina, GMP, GDP o GTP) en el que el 3’OH actúa como nucleófilo.
3. No se necesita fuente de energía porque se utiliza la energía de un tipo particular de transesterificación: la transfosforilación.
4. La unión del cofactor externo desencadena el proceso, sin formación de lazos (lariat).
5. No existen secuencias de consenso claras para producir el ayuste o reconocer los bordes del intrón
6. Se han identificado unas pequeñas secuencias que suelen ser importantes, directa o indirectamente, para el procesamiento. Su conservación sugiere que un ancestro común migró a la mitocondria desde el núcleo, o viceversa. Estas secuencias forman dos estructuras típicas:
• una de ellas está formada por el apareamiento de 6-7 nt entre las secuencias P y Q de 10 nt de longitud (P4 en la figura). En el caso de intrones mitocondriales se denominan secuencias «9L»
• La otra estructura la forma el apareamiento de 5 nt entre los elementos R y S de 12 nt (P7 en la figura). En el caso de intrones mitocondriales, reciben el nombre de «2».

 Esquema de los intrones del grupo I

 Intrón-ribosoma 'cabeza de martillo' 

En las plantas hay unas moléculas de RNA pequeñas (~350 pb) que se conocen como viroides (RNA infeccioso que no se encapsida) y virusoides (RNA infeccioso que se encapsida junto con un virus que luego le ayuda a replicarse). Estos RNA pueden adquirir una conformación que se denomina cabeza de martillo con actividad catalítica: se autohidroliza. Esta estructura consta de 3 brazos cuya posición y tamaño son constantes, y 13 nucleótidos conservados en la región de la cabeza, donde se va a producir el corte.

• Intrones del grupo II

Son mucho menos frecuentes que los anteriores porque sólo aparecen en:

• rRNA, tRNA y mRNA de los orgánulos de los hongos, los protistas y las plantas (los de los animales [¿vertebrados?] carecen siempre de intrones)
• algunos mRNA de las bacterias (descubierto en 1993) y muchos de las arqueas.

Sus principales características son:

1. Se autoprocesan in vivo aunque algunos también necesitan madurasas, y utilizando la energía de la transfosforilación
2. No necesitan un cofactor externo ya que utilizan el 2’OH de un residuo de A del propio intrón
3. Por utilizar como cofactor un nucleótido del intrón, dan lugar a un intermediario en forma de lazo (lariat).
4. Aunque la secuencia de nucleótidos no está conservada, presentan una estructura secundaria formada por 6 horquillas denominadas d1 a d6. En d6 se encuentra la A que comenzará el ataque nucleófilo. El centro catalítico del intrón viene definido por d1 y d5.
5. Con frecuencia se comportan como elementos móviles, por lo que se les considera un tipo particular de retrotransposón. Para saltar a un nuevo lugar (homing) emplean tanto endonucleasas como retrotranscriptasas codificadas por el propio intrón u otros intrones del mismo grupo.

Su estructura y su mecanismo de ayuste se parecen mucho a los intrones nucleares, por lo que se les cree relacionados evolutivamente. Existe un subgrupo de estos intrones que carecen de los dominios d2 a d4 y se denominan frecuentemente intrones del grupo III, que no hay que confundir con los intrones nucleares (véase a continuación).

 

• Intrones nucleares

Es el más numeroso, con intrones presentes en la mayoría de los mRNA nucleares eucarióticos. El ayuste es similar al del grupo II, pero necesita la intervención un conjunto muy numeroso de proteínas y RNA para formar el ayustosoma —con gasto de ATP—. Todavía no se ha encontrado ninguno de este tipo en procariotas.

• Intrones del grupo IV o «de los tRNA»

Agrupa los intrones presentes en los tRNA. A diferencia de los tres anteriores, se necesitan endonucleasas para eliminar el intrón y ligasas para unir los exones. Se han encontrado en los eucariotas y en las arqueas.

• AutocatalíticoTwintrons: intrones siameses o intrones anidados

Se trata de intrones dentro de intrones. Inicialmente se descubrieron sólo en los intrones de grupo II, pero hoy también se han detectado en los de grupo I y unos de grupo II que carecen de los dominios d2 a d4 (de grupo III). El punto común de todos ellos es que se trata de un intrón externo que contiene un ORF —necesario para el ayuste del intrón— que a su vez está interrumpido por un intrón interno. Por tanto, es necesario que se procese primero el intrón interno para recomponer el ORF y que así se pueda procesar el intrón externo. Cuando son móviles, se transmiten juntos.

Los del grupo I se han detectado en los protistas en donde un rRNA contiene un intrón de grupo I autocatalítico y móvil, que codifica una endonucleasa de corte raro necesario para su homing. El ORF de la endonucleasa está interrumpido por un intrón interno autocatalítico del grupo I pero que no es móvil.

Entre los del grupo II podemos señalar el gen psbF del cloroplasto de Euglena. En la horquilla V de este intrón externo de 1042 pb se ha encontrado insertado el intrón interno también del grupo II de 618 pb que debe ayustarse primero para que luego se puedan eliminar los 1042 – 618 = 424 nt restantes.

•  Teorías sobre el origen de los intrones

Existen dos teorías aparentemente opuestas: la primera está defendida por Walter Gilbert (el mismo de la secuenciación) y aboga por la adquisión temprana (o teoría de los exones), es la que presenta más pruebas experimentales y explica mejor todos los fenómenos descritos. Los dos pilares principales de esta teoría son:

1. El barajado de exones: los nuevos genes se puede formar por la yuxtaposición de exones preexitentes mediante una recombinación asistida por los intrones. Además, muchos exones son unidades funcionales independientes, por lo que los genes pueden generarse simplemente mediante composición modular de exones existentes.
2. La antigüedad de los intrones: los intrones son muy antiguos, anteriores a la aparición de los eucariotas. Puesto que:
• A) químicamente el RNA precedió al DNA (los intrones son autocataliticos);
• b) el RNA puede autoreplicarse; y
• c) muchos transposones saltan a través de RNA (existen intrones saltarines),

Por tanto, es muy probable que en el mundo RNA los genes evolucionaran hacia estructuras del tipo intrón-exón que se procesarían mediante ayuste para evitar el salto indeseable de los transposones, o tratar de convivir «pacíficamente» con ellos.

La teoría de la adquisición tardía propone que los intrones nucleares surgen de la incorporación reciente de intrones de grupo II y transposones en el genoma nuclear. Su principal pilar es que los análisis filogenéticos demuestran que los intrones no están distribuidos al azar, y que la densidad de intrones por proteína está muy conservada.

Posiblemente lo que ha ocurrido sean las dos cosas: los intrones son muy antiguos de manera que muchos organismos los han perdido, aunque algunos se han adquirido recientemente. Aunque se han encontrado intrones que rompen las unidades modulares de los exones, éstos son muchísimo menos frecuentes que lo esperado de una distribución al azar.

La presencia de los intrones del grupo II en las eubacterias pero no en las arqueas indicaría que se originaron en las eubacteria antes de que se originaran los eucariotas. Se introdujeron en los eucariotas a través de la mitocondrias y de ahí saltaron al genoma nuclear para convertirse en intrones nucleares. El núcleo riboenzimático de este tipo de intrones se dispersó en pequeños RNA (snRNA) que ahora se necesitan en trans para montar el ayustosoma.

• Procesamiento de los rRNA

Maduración del transcrito primario (pre-rRNA)

La RNA-polimerasa I tarda 3 o 4 minutos en producir un único transcrito de 13.000 nt (pre rRNA 45S) que contiene los genes de los rRNA 18S, 5,8S y 28S. En los humanos, este pre-rRNA sufre 6 cortes endonucleolíticos para dar lugar a los 3 rRNA maduros, en un proceso que dura unos 30 minutos y en el que se desechan más del 50% de los nucleótidos.

 

Ayuste del intrón del rRNA 28S de Tetrahymena

En 1982 Thomas Cech descubrió que el el pre-rRNA de protozoo Tetrahymena contiene un intrón autocatalítico del grupo I de 413 nt en su extremo 3’, sobre rRNA 28S, que se denominó IVS (intervining sequence). Su auto-ayuste se puede dividir en las siguientes etapas:

1. El pre-rRNA forma un bucle sobre el intrón (IVS)
2. El bucle permite que una molécula externa de pG_3’OH ataque el enlace entre U-A dentro de la secuencia CUCUCUpAAA (que se localiza gracias a una secuencia complementaria del intrón), provocando la transesterificación del enlace.
3. El fragmento del exón en 5' ataca ataca la última G del intrón (GpU) de manera que se escinde el bucle intrónico y quedan unidos covalentemente los dos exones con la secuencia UCUpUAA. Nunca se han detectado exones libres, por lo que se piensa que las transfosforilaciones están muy coordinadas.
4. El intrón sufre una tercera transesterificación en el que el 3’OH del intrón (G⁴¹⁴) ataca la A¹⁶ (ciclación secundaria), liberando 15 residuos del extremo 5’, o bien sobre el U²⁰ (ciclación primaria), liberando 19 nucleótidos. Ambas reacciones producen un fragmento de intrón circular que contiene la G que inició el proceso. Por la concurrencia de H₂O, el intrón puede volverse a linealizar específicamente por la G⁴¹⁴, dando a entender que este enlace es específicamente reactivo. Como las moléculas que han sufrido la ciclación primaria todavía pueden sufrir la secundaria, el resultado final es que todos los intrones linealizados han perdido 19 nucleótidos, recibiendo el nombre de L-19 IVS. Esta estructura tiene la capacidad de alargar o acortar pequeños oligonucleótidos actuando como un verdadero catalizador (ribosoma).

 

• Procesamiento de los tRNA

Maduración del transcrito

En una célula hay aproximadamente un millón de copias de los tRNA más usados. En los humanos hay 1.300 copias de genes de tRNA, en las levaduras sólo 250 y sólo 60 en las bacterias. Los genes de los tRNA se encuentran agrupados (la mayoría) en 10 a 100 agrupamientos cromosómicos. Los tRNA maduros miden de 75 a 80 nt, mientras que el transcrito primario suele ser unos 15-30 nt mayor. La secuencia que siguen los tRNA para madurar es la siguiente:

1. Se corta el pre-tRNA en la secuencia guía (líder) en 5’ mediante una RNasa. Se mantiene el fosfato del extremo.
2. De manera similar se procesa el extremo 3’ no codificante que consiste en la secuencia U para el tRNA^Tyr de levaduras. Normalmente son dos nucleótidos.
3. Todavía en el núcleo se añade la secuencia CCA mediante la transferasa terminal —nótese la diferencia con procariotas, en los que la secuencia CCA suele venir con el gen, mientras que el de eucariotas se añade después—. El extremo resultante es un 3’-OH.
4. Se modifican químicamente las bases nitrogenadas, principalmente por metilación y conversión de uridinas en seudouridinas. En general, el 10% de las bases de los tRNA funcionales presentan alguna modificación postranscripcional.
5. Se procesa el intrón, que siempre es del grupo «IV».

 

Ayuste del intrón de grupo «IV»

El tamaño de estos intrones varía de 14 a 60 nt y se encuentra insertado inmediatamente después del anticodón. Los intrones de los tRNA del mismo aminoácido son similares, pero los de aminoácidos diferentes son distintos, no habiéndose detectado secuencias de consenso. Todos contienen una secuencia complementaria a la del anticodón. La secuencia exacta del intrón y su tamaño son irrelevantes, por lo que la eliminación del intrón parece estar relacionada con la estructura secundaria del tRNA más que con la secuencia exacta.

 

Procesamiento de los snRNA del tipo U

Estos RNAs reciben este nombre porque su secuencia es muy rica en uracilo. Las características principales son:

• Los transcribe la RNA-polimerasa II, excepto el U6 que lo transcribe la RNA-polimerasa III.
• Se expresan en todas las células eucarióticas.
• Sus genes suelen estar repetidos en tándem
• Los snRNA no están poliadenilados, pero sí tienen caperuza (cap).
• Necesitan salir al citoplasma para que se eliminen de 2 a 12 nucleótidos en el extremo 3' y así madurar, aunque luego tengan que volver a entrar en el núcleo para cumplir su función.

Según su abundancia en el núcleo se dividen en dos grupos:

• Principales: los U1 a U6 (excepto U3), de los que hay más de 20.000 copias por núcleo. Intervienen en el ayustosoma del tipo U2.
• Otros snRNA: U3 y U7 a U12, son 10 o 100 veces menos abundantes y la función no está tan definida. Muchos de ellos están pasando a denominarse snoRNA (small nucleolar RNA). Las posibles funciones de estos RNA parecen ser:
• U3 interviene en la modificación química o en la terminación de los rRNA, por lo que es de localización nucleolar.
• U7 interviene en la terminación de las histonas.
• U11 (snR U11) interviene en la poliadelinación y a veces en el ayuste, sustituyendo a U1 en los ayustosomas del tipo U12.
• U12 (snR U12) también intervienen en el ayuste sustituyendo a U2 en los ayustosomas del tipo U12.

Procesamiento de los mRNA

Las diferencias entre los procariotas y las eucariotas relativas a la maduración del RNA se centran en el mRNA, ya que hemos visto que el rRNA y el tRNA sufren una maduración similar si excluimos el procesamiento del intrón. El mRNA, además del ayuste, sufre una serie de modificaciones en 5’ y en 3’ que, de forma sucesiva o simultánea, van a ocurrir en el núcleo. Estas modificaciones son la adición de la caperuza, la poliadenilación, ayuste de intrones nucleares y la riboedición (corrección del mRNA).

Adición de la caperuza (cap)

La caperuza o casquete de los mRNA es un 7-metilguanilato unido al primer nucleótido del RNA por un enlace 5’-5’ trifosfato. Esto hace que la guanosina añadida se una en sentido opuesto al del resto de la cadena polinucleotídica. Vimos que los snRNA trascritos por la RNA-polimerasa II también llevan esta caperuza.

 

Poliadenilación de los mRNA

El extremo 3’ de los mRNA no se corresponde con la posición donde se termina la transcripción, sino que es más corto, aunque presente una secuencia adicional en 3’: la cola de poli-A. Para añadir esta cola existe un complejo que posee todas actividades enzimáticas necesarias que se denomina poliadenilosoma y se encuentra íntimamente asociado al dominio CTD de la RNA-polimerasa II. La poliadenilación está estrechamente ligada a la terminación pues el corte del RNA favorece la terminación al desestabilizar la interacción con la RNA-polimerasa.

Aunque la poliadenilación del mRNA se descubrió en 1970, su función todavía no está clara:

• interviene en el transporte del mRNA al citoplasma;
• determina la duración de la semivida del mRNA;
• interviene en la traducción correcta o eficaz del mRNA;
• parece ser la señal que indica los hnRNA que van a madurar y los que no;
• parece ser esencial para el ayuste del último intrón (de forma similar a lo que hace la caperuza con el primer intrón).

La presencia de esta cola es muy útil experimentalmente, ya que permite la purificación de los mRNA celulares empleando técnicas de afinidad con soportes sólidos unidos a un oligo (dT).

 

Terminación de los transcritos de las histonas

El mRNA de las histonas (un 10% del RNA total) no se poliadenila sino que termina en una posición determinada que viene establecida por el snRNA U7 que forma parte de la snRNP U7. Los mRNA de las histonas contienen una horquilla en el extremo 3' con 5 o 6 pb en la parte del tallo y un bucle de 4 nt. A unos 14-17 nt después de la horquilla se aparean 9 nt entre el mRNA y el snRNA U7. A unos 5 nt de la horquilla (antes del dúplex de RNA) se produce el corte que liberará el mRNA maduro.

 

Ayuste de los intrones nucleares

El ayuste es un proceso que puede ocurrir mientras se está transcribiendo el gen o, más habitualmente, una vez que el gen completo está transcrito. La eliminación de un intrón de grupo III (y también de los de grupo II) está determinada por su secuencia o estructura, pero no por su tamaño. Para definir un intrón se necesitan dos secuencias específicas en la unión intrón-exón, que se denominan sitio 5’ o donador y sitio 3’ o aceptor, así como una secuencia interna, denominada sitio de ramificación o CURAY, situada a 18-40 nt del sitio 3’. En conjunto, se llaman sitios o centros de ayuste.